曹珊珊， 李瑞芳， 方偉進(jìn)， 王建剛， 李 艷， 張 博

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河南洛陽(yáng)471003)

高血壓心肌肥厚是充血性心力衰竭重要的誘因及獨(dú)立危險(xiǎn)因子，高血壓導(dǎo)致的心肌肥大在體循環(huán)高負(fù)荷長(zhǎng)期存在時(shí)，心肌會(huì)發(fā)生失代償，出現(xiàn)充血性心力衰竭，增加死亡率［1］。研究表明，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的紊亂可以促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和胚胎基因表達(dá)，從而影響心臟的功能［2］?；蛘{(diào)控與組蛋白的乙酰化和去乙?；嘘P(guān)，而這一過(guò)程主要由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)調(diào)節(jié)。近年來(lái)國(guó)外有少數(shù)學(xué)者初步發(fā)現(xiàn):在心肌肥厚過(guò)程中HDACs有可能發(fā)揮著一定的作用［3］。在心肌肥厚的十分復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，HDACs是一個(gè)重要的下游融合節(jié)點(diǎn)，調(diào)節(jié)許多與肥厚相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，可能是治療心肌肥厚的一個(gè)很有意義和前景的作用靶標(biāo)。資料顯示，Ⅰ型HDACs中的HDAC1、2和3可促進(jìn)心肌肥厚［4］，而HDAC8對(duì)心肌肥厚的影響未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)采用2腎2夾腎性高血壓心肌肥厚模型，觀(guān)察左心室肥厚時(shí)HDAC8的表達(dá)變化以及用丙戊酸鈉(valproic acid sodium，VPA)抑制HDAC8的表達(dá)后對(duì)心肌肥厚的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 丙戊酸鈉(批號(hào)為090415)，購(gòu)自南開(kāi)允公藥業(yè);戊巴比妥鈉購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑廠(chǎng);ExTaq酶、RNase抑制劑、AMV購(gòu)自TaKaRa;Trizol核酸提取試劑購(gòu)自 Invitrogen;抗兔的多克隆抗體HDAC8(H-145)(稀釋度1∶500)購(gòu)自 Santa Cruz，抗鼠的單克隆抗體α-tubulin(稀釋度1∶10 000)購(gòu)自Sigma。

1.2 動(dòng)物 體重90～110 g的雄性SD大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)為20100008)。

2 方法

2.1 心肌肥厚模型制備、分組及標(biāo)本采集 參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行，以1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，做背部后正中切口，分離腎動(dòng)脈起始部0.5 cm處放置鈦合金夾。假手術(shù)組僅分離腎動(dòng)脈。術(shù)后2周血壓開(kāi)始上升，排除術(shù)后4周血壓小于160 mmHg的大鼠。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組，每組10只。(1)假手術(shù)組(sham):腹腔注射等量生理鹽水;(2)2腎2夾組(two-kidney two-clip，2K2C):腹腔注射等量生理鹽水;(3)丙戊酸鈉高劑量組(valproic acid sodiumhigh dose，VpaH):術(shù)后腹腔注射丙戊酸鈉，400 mg·kg-1·d-1VPA;(4)丙戊酸鈉低劑量組(VpaL):200 mg·kg-1·d-1VPA;(5)坎地沙坦組(candesartan，Can):按10 mg·kg-1·d-1灌胃;術(shù)后 4 周開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥4周，所有動(dòng)物于術(shù)后8周摘取心臟，稱(chēng)取左心室(包括室間隔)重量(left ventricular weight，LVW)，并與體質(zhì)量(body weight，BW)相除，計(jì)算左心室/體重比值(LVW/BW)。取左心室游離壁心肌放入10% 中性甲醛內(nèi)，24 h后石蠟包埋切片，HE染色。其余心底以及心尖部分放入凍存管中液氮保存。

2.2 常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素室溫染10 min，快速自來(lái)水沖洗30～60 s;1%鹽酸乙醇分化1 s，自來(lái)水沖洗1 min;伊紅室溫染5～10 min;梯度乙醇脫水;二甲苯透明;中性樹(shù)膠封片，光鏡觀(guān)察拍照。

2.3 RT-PCR測(cè)定心肌組織心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)和 HDAC8 mRNA 表達(dá) 用Trizol提取心肌組織中的總RNA，測(cè)定總RNA純度和水平，取2 μg總RNA樣本在10μL反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取cDNA 2 μL參照Taq酶說(shuō)明書(shū)在10 μL體系中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，65.1℃(ANF)或56.1℃(HDAC8)或52℃(18S)30 s，72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)(ANF)或35個(gè)循環(huán)(HDAC8)或27個(gè)循環(huán)(18S)，72℃ 10 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像并讀出電泳帶吸光度值，用目的條帶與18S的吸光度比值來(lái)反映目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工合成，ANF上游引物5'-CTG CTA GAC CAC CTG GAG GA-3'，下游引物 5'-AAG CTG TTG CAG CCT AGT CC-3'(Tm:65.1℃，320 bp)。HDAC8上游引物5'-CCA GAA GGT CAG CCA AGA-3'，下游引物 5'-TTC CGT CGC AAT CGT AAT-3'(Tm:56.1℃，267 bp)。18S上游引物5'-GTC CCC CAA CTT CTT AGA G-3'，下游引物5'-CAC CTA CGG AAA CCT TGT TAC-3'(Tm:52 ℃，419 bp)。

2.4 Western blotting測(cè)定HDAC8的表達(dá) 提取各組心肌組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整上樣量為50 μg，10%SDS-PAGE，PVDF 膜印跡，室溫封閉1 h，Ⅰ抗4℃過(guò)夜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色。LabWork 4.0凝膠蛋白分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 2腎2夾腎性高血壓大鼠心肌組織中HDAC8的表達(dá)變化

圖1A顯示，各組大鼠心肌組織中均有HDAC8的表達(dá)，手術(shù)后8周，高血壓大鼠左心室的HDAC8 mRNA含量明顯上調(diào)，為假手術(shù)組的2.8倍(P＜0.05)，高、低劑量丙戊酸鈉均可下調(diào)左心室HDAC8 mRNA的水平，分別降至2腎2夾組的50%和61%(P＜0.05)，且具有劑量依賴(lài)性。

圖1B顯示，2K2C大鼠左心室HDAC8蛋白的表達(dá)水平明顯升高，為假手術(shù)組的1.7倍，給予高、低劑量的丙戊酸鈉干預(yù)后，HDAC8的蛋白表達(dá)明顯減少，分別降為2腎2夾組的約59%和65%。

Figure 1.The mRNA(A)and protein(B)expression of HDAC8 in the left ventricle of the two-kidney two-clip renovascular hypertensive rats after 8 weeks.The experiment was repeated three times with the same result.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.圖1 2腎2夾高血壓大鼠左心室HDAC8 mRNA和蛋白的表達(dá)變化

2 HDAC8抑制劑對(duì)大鼠左心室/體重比值的影響

2腎2 夾縮窄術(shù)后，大鼠的體重逐漸增長(zhǎng);給予丙戊酸鈉后對(duì)體重增加沒(méi)有明顯影響，各組間沒(méi)有顯著差異。而表1顯示，2腎2夾組大鼠的左心室/體重比值(LVW/BW)相對(duì)假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05)，提示2腎2夾組大鼠發(fā)生了明顯的左心室肥厚。高劑量丙戊酸鈉可以降低LVW/BW，能明顯緩解這種腎性高血壓引起的心肌肥厚。低劑量丙戊酸鈉也有一定降低LVW/BW作用，但弱于高劑量組。陽(yáng)性對(duì)照藥坎地沙坦可以明顯降低LVW/BW，效果與VPA高劑量組類(lèi)似。

3 HDAC抑制劑對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

病理切片(HE)染色顯示，與假手術(shù)組相比，2K2C組大鼠心肌細(xì)胞橫徑和表面積增大，邊緣不規(guī)則，并有心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核增大、畸形等改變?？驳厣程菇M明顯抑制這種變化，丙戊酸鈉高劑量組也能抑制這種變化，且效果優(yōu)于低劑量組，見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠2腎2夾術(shù)后8周LVW/BW的檢測(cè)結(jié)果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

表1 各組大鼠2腎2夾術(shù)后8周LVW/BW的檢測(cè)結(jié)果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 2K2C.LVW:left ventricular weight;BW:body weight.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.

Group LVW(mg) BW(g)LVW/BW(mg/g)Sham 460±50 300±13 1.54±0.13 2K2C 600±60* 295±18 2.06±0.25*VpaH 470±40# 300±18 1.61±0.16##VpaL 530±15*# 303±7 1.89±0.29*#Can 460±7## 303±18 1.55±0.18##

Figure 2.Effects of VPA on the histomorphology of left ventricular myocardium 8 weeks after 2K2C operation(HE statining，×200).A:representative transversal section morphology;B:representative longitudinal section morphology.圖2 2腎2夾術(shù)后8周丙戊酸鈉對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

4 HDAC抑制劑對(duì)大鼠心肌組織中ANF mRNA表達(dá)的影響

在術(shù)后8周2腎2夾腎性高血壓大鼠中，ANF mRNA的表達(dá)為假手術(shù)組的3.6倍(P＜0.05)，丙戊酸鈉高、低劑量組均可抑制ANF mRNA的表達(dá)，分別降至2腎2夾組的36%和69%(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

Figure 3.Expression of ANF mRNA in the LV of rats treated with VPA or candesartan.The results were representative of three independent experiments.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.圖3 各組大鼠心肌組織ANF mRNA的表達(dá)

高血壓左室肥厚是以心肌細(xì)胞肥大及成纖維細(xì)胞增殖為主要病理學(xué)特征的高血壓性臟器損害，因其病因不清、機(jī)制復(fù)雜，缺乏確切有效的防治措施［6］。近期研究發(fā)現(xiàn)HDACs抑制劑曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)和VPA能夠顯著改善胸主動(dòng)脈結(jié)扎(thoracic aortic banding，TAB)引起的心肌肥大和重構(gòu)，還可以通過(guò)增加組蛋白的乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)心臟肥大基因和胚胎期基因活化［7-8］。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，TSA可以上調(diào)α-肌球蛋白重鏈的表達(dá)，VPA可以下調(diào)HDAC2的表達(dá)來(lái)防止AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大反應(yīng)［9-10］。盡管上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明了HDACs抑制劑具有明顯的抗肥厚作用，但上述體內(nèi)模型與臨床實(shí)際病變存在差距。主動(dòng)脈結(jié)扎模型可以引起心臟后負(fù)荷的急劇增加，并不是一種反映高血壓和動(dòng)脈硬化引起的心臟病變的理想模型，所以我們選用更接近臨床的2腎2夾腎性高血壓模型觀(guān)察HDACs抑制劑對(duì)心肌肥厚的作用。

目前，國(guó)外關(guān)于HDACs的研究主要集中在抗癌領(lǐng)域，而在心肌肥厚發(fā)病中的研究主要是通過(guò)基因敲除鼠來(lái)闡明不同HDACs亞型的功能［11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在2腎2夾術(shù)后6周腎性高血壓大鼠心臟中HDAC2的表達(dá)增加同時(shí)出現(xiàn)了顯著的心肌肥大和纖維化，提示在腎性高血壓大鼠的心肌重構(gòu)中，HDACs起了十分重要的作用，但其同工酶HDAC8在2腎2夾腎性高血壓大鼠左心室的表達(dá)是否增加，下調(diào)其表達(dá)對(duì)心肌肥厚的影響如何，尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文在研究2腎2夾腎性高血壓大鼠左心室肥厚的基礎(chǔ)上首次觀(guān)察到隨著左室心肌細(xì)胞內(nèi)HDAC8 mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，心肌肥厚標(biāo)志性基因ANF在左心室的表達(dá)也增加，提示HDAC8可能參與腎性高血壓左心室肥厚發(fā)病過(guò)程并促進(jìn)肥厚的發(fā)展。另外，本研究發(fā)現(xiàn)VPA可以劑量依賴(lài)性下調(diào)HDAC8 mRNA和蛋白表達(dá)，減少ANF mRNA表達(dá)，說(shuō)明VPA在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平對(duì)HDAC8都起著重要的調(diào)控作用。同時(shí)VPA治療組左心室肥厚顯著改善，心肌形態(tài)病理學(xué)改變得到部分逆轉(zhuǎn)，左心室重量指數(shù)下降。上述結(jié)果提示HDACs抑制劑VPA可能通過(guò)下調(diào)HDAC8的表達(dá)逆轉(zhuǎn)心肌肥厚?？傊覀兊慕Y(jié)果表明HDAC8參與了腎性高血壓大鼠心肌肥厚的發(fā)病過(guò)程，下調(diào)其表達(dá)可以防止心肌肥厚的發(fā)生。為了進(jìn)一步揭示HDAC8在心肌肥厚的作用機(jī)制，我們接下來(lái)將進(jìn)一步檢測(cè)與HDAC8相伴隨的 calcineurin(CaN)和 Akt/GSK3β信號(hào)分子及轉(zhuǎn)錄因子NFATc4、AP-1的表達(dá)變化，從基因轉(zhuǎn)錄的乙?；揎椪{(diào)控對(duì)心肌肥大的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探討。

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