劉志龍， 曹明溶△， 李 強(qiáng)， 高 明， 蔣建偉

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院普通外科，2醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣東 廣州510632)

青蒿琥酯(artesunate，ART)是青蒿素的主要衍生物之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外對肝癌均有抑制作用。研究［1］發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對正常肝細(xì)胞毒性小，而對P53野生型及突變型肝癌細(xì)胞均有抑制作用。王勤等［2］給荷瘤鼠口服青蒿琥酯后，亦能明顯抑制肝癌的生長。但目前有關(guān)青蒿琥酯和抗腫瘤藥物合用的報(bào)道較少。我們觀察了青蒿琥酯在體外對人肝癌細(xì)胞系HepG2的生長抑制與誘導(dǎo)凋亡作用，并對其與臨床常用抗腫瘤藥物合用后的效果進(jìn)行了研究。

材料和方法

1 主要材料及儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞由暨南大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈。ART化學(xué)對照品，分子式:C19H28O8，分子量:384.43，棕色小瓶裝，生產(chǎn)批號為100200－200202，購自中國藥品生物制品檢定所;新生牛血清(newborn calf serum)，生產(chǎn)批號為071222，購自杭州四季青生物工程材料有限公司;DMSO、胰蛋白酶(trypsin，1∶250)、Hoechst 33258、碘化丙啶、臺盼藍(lán)(typan blue)均購自Sigma;RPMI－1640培養(yǎng)液購自Gibco;Annexin V－PI雙染試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)公司;CCK－8(cell count kit－8)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑購自同仁化學(xué)研究所。

2 方法

2.1 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 在細(xì)胞對數(shù)生長期，將人肝癌HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成5×107cells/L接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，即每孔細(xì)胞約為5 000個，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為150 μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，對照組以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊，每組設(shè)3個復(fù)孔，ART作用 HepG2細(xì)胞終濃度為 200 μmol/L、100 μmol/L、80 μmol/L、50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK－8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A)(測定波長450 nm，參比波長655 nm)，計(jì)算各組增殖抑制率，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。增殖抑制率(%)=(1－A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成3×105cells/L接種于12孔培養(yǎng)板，1 mL/well，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為1 500 μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，ART 作用終濃度為 10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L，培養(yǎng) 7 d 后，吸去培養(yǎng)液，PBS 洗滌 2次后，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定10 min后晾干，吉姆薩染色15 min后流水沖洗，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆(＞20個細(xì)胞記1個克隆)并拍照，克隆形成抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)/對照組細(xì)胞克隆數(shù))×100%，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化將HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成1×108cells/L接種于6孔培養(yǎng)板，2 mL/well，每組設(shè)2個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為2 500 μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，ART作用終濃度為25 μmol/L，培養(yǎng)48h后消化收集細(xì)胞:(1)以1 000 r/min離心6 min，棄上清;(2)PBS重懸細(xì)胞，離心洗滌2次;(3)留少許上清，用微量加樣器吸取細(xì)胞在潔凈載玻片上涂片，室溫自然干燥;(4)甲醇∶冰醋酸 (3∶1)固定液固定15 min;(5)晾干后于暗處用Hoechst 33258染色工作液(10 mg/L)避光染色10 min;(6)雙蒸水沖洗5 min，甘油封片，熒光顯微鏡觀察并拍照(紫外光340nm波長)。

2.4 PI單染檢測亞二倍體率和細(xì)胞周期 將HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成1×108cells/L接種于6孔培養(yǎng)板，2 mL/well，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為2 500μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，ART作用終濃度為 50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，先用600 μL PBS液重懸細(xì)胞，再加入無水乙醇1.4 mL(最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%)，4℃固定過夜，離心去上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次后，加入PI染色液(含 RNase酶)，終濃度50 mg/L，避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量，每個樣本隨機(jī)分析12 000個細(xì)胞，得各組細(xì)胞亞二倍體率和細(xì)胞生長周期比例，BD FAC Sort Cell Quest軟件分析處理結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 Annexin V－PI雙染測定細(xì)胞凋亡比例 將HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成1×108cells/L接種于6孔培養(yǎng)板，2 mL/well，每組設(shè)2個復(fù)孔，培養(yǎng)12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為2 500 μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，ART作用終濃度為 50 μmol/L、25 μmol/L、12.5 μmol/L，培養(yǎng) 48 h后消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，吸盡上清，加入200 μL試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入 FITC 標(biāo)記的10 μL Annexin V 和5 μL PI，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測。Annexin V－FITC陽性且PI陰性的細(xì)胞群(即LR細(xì)胞群)為早期凋亡細(xì)胞群，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞懸液調(diào)成5×107cells/L接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，即每孔細(xì)胞約為5 000個，培養(yǎng)12 h后加藥，每孔加入藥物后終體積為150 μL/well(不足體積以不含血清RPMI－1640培養(yǎng)液補(bǔ)齊)，每組設(shè)3個復(fù)孔，對每一種藥物均設(shè):對照組、單獨(dú)化療藥物組、化療藥物與ART組、單獨(dú) ART組。ART終濃度為3.5 μmol/L，5－氟尿嘧啶(5－fluorouracil，5－FU)終濃度為16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L、0.125 mg/L，卡鉑終濃度為 6 mg/L、3 mg/L、1.5 mg/L、0.8 mg/L、0.4 mg/L、0.2 mg/L，表柔比星終濃度為0.2 mg/L、0.1 mg/L、0.05 mg/L、0.025 mg/L。培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK－8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度值，計(jì)算各組增殖抑制率及IC50，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)抑制率計(jì)算金正均q值來判斷化療藥物與ART聯(lián)合使用的效果:q=Ea+b/(Ea+Eb－Ea×Eb)，Ea和Eb分別為單用ART和單用化療藥物的抑制率，Ea+b為合并用藥的抑制率。式中分子代表“實(shí)測合并效應(yīng)”，分母是“期望合并效應(yīng)”，q值是兩者之比，q＜0.85為拮抗效應(yīng)，0.85≤q＜1.15為相加效應(yīng)，q≥1.15為協(xié)同效應(yīng)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 CCK－8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

不同濃度ART作用HepG2細(xì)胞48 h后，與對照組相比細(xì)胞較為稀疏，細(xì)胞間隙大，有較多的細(xì)胞變圓，體積小，貼壁慢，部分細(xì)胞不貼壁或貼壁不牢，易被消化離壁;細(xì)胞增殖受到抑制，差異顯著(P＜0.01)，隨著藥物濃度的升高，抑制率逐漸升高，IC50為19.2 μmol/L，說明ART以劑量依賴的方式抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

2 ART對HepG2細(xì)胞克隆形成的影響

隨著濃度增加，各組ART作用HepG2細(xì)胞7 d后，與對照組相比較克隆形成數(shù)量明顯減少，且克隆逐漸變小，青蒿琥酯濃度為2.5 μmol/L 、5 μmol/L 、10 μmol/L時，克隆形成抑制率分別為:(13.80±2.22)% 、(25.84±2.93)%、(50.37±4.52)%，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)與對照組相比均差異顯著(P ＜0.01)。

3 Hoechst 33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

ART組與對照組細(xì)胞相比可見明顯凋亡細(xì)胞，如核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)變化。

4 PI單染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和亞二倍體百分率

ART組細(xì)胞周期比例與對照組細(xì)胞相比，隨ART濃度升高，G2期細(xì)胞比例明顯上升(P＜0.01)，G1細(xì)胞減少。提示ART可能延緩了HepG2由G2期向M期的過渡，見圖1。

ART組與對照組相比，ART組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著ART濃度的增大，HepG2細(xì)胞的亞二倍體率增加。對照組、ART 12.5 μmol/L組、ART 25 μmol/L 組和 ART 50 μmol/L 組各組的亞二倍體百分率分別為:(4.86±0.38)%、(20.40±0.60)%、(24.90±0.20)%、(28.70±0.72)%，ART各組與對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)。

5 Annexin V－PI雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

各組藥物作用人肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率，左下限(LL)為正常細(xì)胞群，右下限(RL)為早期凋亡細(xì)胞群，右上限(RU)為晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞群，見圖2。ART各組細(xì)胞早期凋亡率與對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)。

6 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

6.1 ART聯(lián)合5－FU對HepG2的增殖抑制作用單獨(dú)5－FU作用人肝癌 HepG2細(xì)胞48 h，IC50為8.59 mg/L，與3.5 μmol/L 的 ART聯(lián)合作用后，IC50為2.58 mg/L，增敏倍數(shù)為3.33。其中0.125 mg/L 5－FU與3.5 μmol/L ART聯(lián)合為協(xié)同作用，q值為1.17，見表 1。

6.2 ART聯(lián)合卡鉑對HepG2的增殖抑制作用 單獨(dú)卡鉑作用人肝癌 HepG2細(xì)胞48 h，IC50為2.63 mg/L;與 3.5 μmol/L ART 聯(lián)合作用后，IC50為 1.30 mg/L，增敏倍數(shù)為2.02。其中0.2 mg/L卡鉑及0.4 mg/L卡鉑與3.5 μmol/L ART聯(lián)合為協(xié)同作用，q值分別為1.18和1.28，見表2。

Figure 1.PI staining showed characteristic features of apoptosis in ART－exposed cells.The percentage of cells in G2 phase increased compared with the control group.±s.n=3.圖1 PI單染流式細(xì)胞儀檢測ART對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期改變

Figure 2.Staining cells with Annexin V－FITC and PI were used to distinguish and quantitatively determine the percentage of apoptotic cells.The apoptotic rate increased in a dose－dependent manner.±s.n=3.圖2 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果代表圖

表1 5－FU聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增值抑制作用Table 1.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with 5－FU(±s.n=3)

表1 5－FU聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增值抑制作用Table 1.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with 5－FU(±s.n=3)

5－FU 5－FU combined with 3.5 μmol/L ART Concentration(mg/L)qvalue Inhibitory rate(%)5－FU concentration(mg/L)Inhibitory rate(%)0 0 0 19.46±4.00…0.125 3.59±2.21 0.125 26.33 ±2.82 1.17 0.25 15.48±4.62 0.25 28.99 ±8.04 0.91 0.5 25.02±2.81 0.5 29.54 ±7.90 0.75 1.0 30.69±3.64 1.0 32.66 ±6.77 0.74 2.0 43.88±2.46 2.0 48.33 ±4.60 0.88 4.0 46.12±2.70 4.0 56.29 ±3.59 0.99 8.0 48.06±0.68 … … …16.0 56.89±3.31… … …

表2 卡鉑聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Table 2.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with carboplatin(±s.n=3)

表2 卡鉑聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Table 2.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with carboplatin(±s.n=3)

Carboplatin Carboplatin combined with 3.5 μmol/L ART Concentration(mg/L)Inhibitory rate(%)0 0 0 22.52±6.15 Inhibitory rate(%)Carboplatin Concentration(mg/L)qvalue…0.2 8.75±4.35 0.2 34.51 ±3.02 1.18 0.4 14.64±7.21 0.4 43.20 ±8.24 1.28 0.8 28.64±2.35 0.8 45.71 ±1.04 1.02 1.5 42.57±2.01 1.5 47.46 ±2.41 0.86 3.0 52.51±1.12 3.0 57.98 ±0.63 0.92 6.0 59.80±0.52 6.0 63.06 ±2.04 0.74

6.3 ART聯(lián)合表柔比星對HepG2的增殖抑制作用 單獨(dú)表柔比星作用人肝癌HepG2細(xì)胞48 h，IC50為0.12 mg/L;與3.5 μmol/L ART 聯(lián)合作用后，IC50為0.07 mg/L，增敏倍數(shù)為1.71。其中0.025 mg/L表柔比星與3.5 μmol/L ART聯(lián)合為協(xié)同作用，q值為1.17，見表3。

表3 表柔比星聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Table 3.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with epirubicin(±s.n=3)

表3 表柔比星聯(lián)合3.5 μmol/L ART對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Table 3.Effects of ART on HepG2 cell growth inhibition in combination with epirubicin(±s.n=3)

Epirubicin Epirubicin combined with 3.5 μmol/L ART Concentration(mg/L)Inhibitory rate(%)Inhibitory rate(%)Epirubicin concentration(mg/L)qvalue 0 0 0 21.12±4.32…0.025 15.14±6.35 0.025 38.79 ±2.72 1.17 0.05 28.54±2.49 0.05 45.30 ±4.34 1.04 0.1 47.80±5.97 0.1 55.71 ±2.54 0.95 0.2 61.86±4.95 0.2 64.46 ±3.11 0.92

討 論

青蒿素被列入治療瘧疾的基本藥物已多年，安全可靠［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，這類藥物尚有廣譜抗癌活性。范鈺等［4］研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠有效抑制乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，且呈濃度和時間依賴性。Efferth等［5］報(bào)道青蒿琥酯對55株腫瘤細(xì)胞的體外抑瘤作用，結(jié)果顯示青蒿琥酯對白血病、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中樞神經(jīng)腫瘤和腎癌細(xì)胞株均有效果。Hou等［1］將青蒿琥酯作用于肝癌細(xì)胞系HepG2(P53野生型)、Huh－7和 BEL－7404(P53突變型)、Hep3B(P53缺失型)及一種正常肝細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種肝癌細(xì)胞均發(fā)生增殖抑制，出現(xiàn)明顯凋亡細(xì)胞，而正常肝細(xì)胞的生長沒有發(fā)生明顯變化，同時青蒿琥酯能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。張星等［6］報(bào)道青蒿酯鈉能抑制肝癌細(xì)胞系BEL－7402增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致，經(jīng)青蒿琥酯處理后，肝癌細(xì)胞增殖受到明顯抑制，出現(xiàn)了較多典型的凋亡細(xì)胞，亞二倍體率及凋亡細(xì)胞比例都顯著上升，進(jìn)一步證實(shí)了青蒿琥酯能抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

隨著診療技術(shù)的進(jìn)步以及高危人群的普查和重點(diǎn)隨訪，早期肝癌和小肝癌的檢出率和手術(shù)根治切除率逐年增加，加上肝動脈化療栓塞、放療、射頻消融、氬氦刀、微波凝固、化療、生物和免疫治療等綜合治療的應(yīng)用，肝癌的治療效果有所提高。但大部分肝癌起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，待診斷明確時大多屬中晚期，再加上我國肝癌患者多數(shù)有慢性乙型肝炎病史，肝功能及全身情況較差，喪失了手術(shù)切除的機(jī)會，而在臨床上肝癌對放化療并不十分敏感。在體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯與常用化療藥物，如5－FU、卡鉑和表柔比星聯(lián)合作用以后，化療藥物的IC50值較單獨(dú)應(yīng)用時明顯降低，增敏倍數(shù)分別為3.33、2.02和1.71，并且當(dāng)較低濃度化療藥物與3.5 μmol/L青蒿琥酯聯(lián)合時，計(jì)算出q值大于1.15，說明二者聯(lián)合后有協(xié)同作用。有報(bào)道［7］將青蒿琥酯聯(lián)合β射線作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CHG－5，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠增強(qiáng)β射線對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，這提示青蒿琥酯可以作為肝癌放化療過程中的輔助治療措施，以提高肝癌對放化療的敏感性。

我國肝癌患者大多具有病毒性肝炎－肝硬化－肝癌的發(fā)展過程，已有報(bào)道指出青蒿琥酯具有抗乙型肝炎病毒［8］、改善組織纖維化［9］的作用，提示青蒿琥酯有可能成為在肝癌預(yù)防及治療各個階段都可以發(fā)揮作用的有效藥物。

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