雷 楊 張志毅 劉文鳳 王 興 安新民 林善枝

(林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083)

鄭會(huì)全

(廣東省林業(yè)科學(xué)研究院)

植物在自然界往往受到各種生物與非生物脅迫的不利影響，因此經(jīng)過漫長(zhǎng)演化過程，產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制。病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related proteins，PRs/PRP)是植物在各種病原物的侵染及所引起的相關(guān)脅迫(病原菌、線蟲、昆蟲、食草動(dòng)物等生物脅迫)，以及模擬病原物侵害效應(yīng)或類似脅迫的化學(xué)試劑(水楊酸(SA)、乙烯(ET)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)等激素)的施用下誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的一類蛋白質(zhì)的總稱，可作為下游防衛(wèi)基因，是植物防衛(wèi)反應(yīng)體系的重要組成部分[1－2]。PRP最初由Van Loon等[2]從被煙草花葉病毒侵染的煙草葉片中分離獲得，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)PRs廣泛存在于不同植物中，并逐漸形成了以蛋白序列的同源性、等電點(diǎn)、電泳遷移率(相對(duì)分子質(zhì)量)、植物來(lái)源、生理活性以及血清學(xué)關(guān)系為標(biāo)準(zhǔn)的分類體系，進(jìn)而將其分為17個(gè)家族[3－4]。其中PR－1雖具有抗真菌活性，但功能和作用機(jī)制至今未知[5];PR－2具有 β－1，3－葡聚糖酶活性，PR－3、PR－4、PR－8 和PR－11具有幾丁質(zhì)酶活性，可抵御真菌;PR－5為類奇甜蛋白;PR－6為蛋白酶抑制劑，能夠防御昆蟲和線蟲;PR－7、PR－9、PR－10 分別為蛋白酶、過氧化物酶和核酶;PR－12～PR－16分別由防御素、硫素、轉(zhuǎn)脂蛋白、草酸氧化酶和類草酸氧化酶組成;PR－17含有類似鋅蛋白酶活性位點(diǎn)的序列，但具體功能未知。

盡管目前已從眾多物種中分離獲得 PRs，但PRs受誘導(dǎo)表達(dá)在物種間差異很大，并非所有的PR家族均存在于每一物種中;而且以往研究多集中于擬南芥、煙草、水稻、大麥、玉米、苜蓿等草本植物。楊樹作為木本模式植物[6]和重要的人工栽培林樹種，其抗病研究一直是林木抗逆育種的熱點(diǎn)。毛白楊(Populus tomentosa Carr.)是我國(guó)特有的白楊派鄉(xiāng)土樹種，具有分布廣、速生、抗逆性強(qiáng)、材質(zhì)優(yōu)良等特性[7]。因此，本文以毛白楊為試材，經(jīng)過SA和Me-JA誘導(dǎo)處理，分離獲得多個(gè)編碼病程相關(guān)蛋白的基因序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)基因結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，從中探討木本植物病程相關(guān)蛋白的功能及抗病信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

用于誘導(dǎo)處理的毛白楊組培苗保存于北京林業(yè)大學(xué)林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。將組培苗移栽至土壤中2個(gè)月后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的植株作為試驗(yàn)材料。

材料處理:以移栽2個(gè)月后的毛白楊植株為試材，向每株葉片完全展開的區(qū)域(2～4葉片間)分別噴灑10 mL外源SA溶液(5 mmol/L)和MeJA溶液(200 μmol/L)，以噴灑相同體積的雙蒸水(ddH2O)為對(duì)照。各種處理后的材料用透明袋密封，在處理6、12、24和48 h后，分別采集處理過的葉片。

總DNA與總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成:對(duì)采集的經(jīng)處理葉片分別提取總 DNA和總RNA。總 DNA的提取采用 Tiangen植物基因組DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing);總 RNA的提取依照 SV Total RNA Isolaton System 試劑盒(Promega Biotech Co.，Ltd.，USA)的方法進(jìn)行。以總RNA為模板，采用Reverse Transcription System(Promega Biotech Co.，Ltd.，USA)合成第一鏈cDNA。

RT－PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增:通過分析楊樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得病程相關(guān)蛋白基因PR－1、PR－5、PR－10的電子克隆序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，如表1所示。PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL(其中 cDNA 2 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.8 mmol/L，上下游引物各 0.4 μmol/L，Taq酶1.25 U)。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸40 s，循環(huán)35次;72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行分離回收和純化。

表1 用于RT－PCR反應(yīng)的引物序列

克隆與測(cè)序:將PCR回收產(chǎn)物與pGEM－T載體連接，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌后，利用菌落PCR擴(kuò)增輔以藍(lán)白斑篩選鑒定陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆單菌落搖菌，送GENEWIZ公司測(cè)序。

生物信息學(xué)分析:測(cè)序結(jié)果先通過DNASTAR Lasergene v7.1推測(cè)出蛋白序列，再經(jīng)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和 SMART(http://smart.embl－h(huán)eidelberg.de/)分析同源性和蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域，SWISS－MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)模擬蛋白三維結(jié)構(gòu)[8－10]。使用 ClustalX2.0、BioEdit7.01 和 MEGA4.1，采用鄰接法(Neighbor－Joining，N－J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用1000次重復(fù)的自展檢驗(yàn)評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此外，通過 CBS(http://www.cbs.dtu.dk/index.shtml)在線分析信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)等信息。

實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR分析:將不同處理的毛白楊葉片總RNA分別合成第一鏈cDNA后，通過DNA Engine Opticon 2 Real－Time Cycler熒光定量分析儀使用SYBR Premix ExTaq試劑盒(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.，Dalian)，采用 SYBR Green I相對(duì)定量法對(duì)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行分析。選用ACTIN作為內(nèi)參基因，引物序列參照Regier等[11];對(duì)應(yīng)不同的病程相關(guān)蛋白基因的qRTPCR引物的設(shè)計(jì)，參照Rinaldi等[12]，并由 Invitrogen公司合成，序列如表2所示。

表2 用于qRT－PCR反應(yīng)的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 毛白楊病程相關(guān)蛋白基因的克隆與分析

2.1.1 PtPR－1 基因序列的分析

毛白楊PR－1基因(HM589199)無(wú)內(nèi)含子(圖1)，讀碼框?yàn)?86 bp，可編碼一個(gè)161aa的前體蛋白，包含136aa的成熟肽和一段25aa的信號(hào)肽。去除信號(hào)肽的成熟PtPR－1蛋白，包含一個(gè)SCP結(jié)構(gòu)域，分子量為14.6 KD，等電點(diǎn)為8.24，為堿性蛋白。經(jīng)預(yù)測(cè)后分析，PtPR－1蛋白序列中無(wú)糖基化位點(diǎn)，而其磷酸化位點(diǎn)可能位于3處絲氨酸(Ser28、128、150)，2處蘇氨酸(Thr66、121)和 6處酪氨酸(Tyr32、57、78、105、107、120)(圖 2)。

圖1 毛白楊病程相關(guān)蛋白基因PR－1、PR－5、PR－10的PCR擴(kuò)增

圖2 PtPR－1、PtPR－5、PtPR－10 基因序列分析

多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，雖然信號(hào)肽序列差異顯著，但毛白楊PR－1前體蛋白序列的相似度與其他物種相比仍保持在很高的水平，分別為擬南芥(Arabidopsis thaliana，P33154.1)63%、馬鈴薯(Solanum phureja，Q08697.1)53%、西洋接骨木(Sambucus nigra，Q41359.1)62%、煙草(Nicotiana tabacum，P07053.1)60%(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，多物種間PR－1家族同源性很高(圖4)。另外，PtPR－1前體蛋白中的信號(hào)肽為α螺旋結(jié)構(gòu)，而模擬的成熟蛋白結(jié)構(gòu)含有3個(gè)α螺旋、4個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)、6個(gè)半胱氨酸形成3個(gè)二硫鍵(圖4)。

圖3 PtPR－1、PtPR－5、PtPR－10 氨基酸序列多重比對(duì)

2.1.2 PtPR－5 基因序列的分析

毛白楊PR－5基因(HM589200)無(wú)內(nèi)含子(圖1)，讀碼框?yàn)?78 bp，可編碼一個(gè)225aa的前體蛋白，包含200aa的成熟肽和一段25aa的信號(hào)肽;而去除信號(hào)肽的成熟PtPR－5蛋白(分子量21.7KD、等電點(diǎn)6.21)，為酸性蛋白，包含一個(gè)THN結(jié)構(gòu)域，其核心結(jié)構(gòu)為 G－x－[GF]－x－C－x－T－[GA]－D－C－x－(1，2)－G－x－(2，3)－C[13－14]。經(jīng)預(yù)測(cè)分析，PtPR－5蛋白序列中可能的磷酸化位點(diǎn)位于3處絲氨酸(Ser5、123、161)，2 處蘇氨酸(Thr73、105)和 2 處酪氨酸(Tyr176、200)(圖2)。與其他物種PR－5家族序列多重比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，除信號(hào)肽序列顯著差異外，毛白楊PR－5前體蛋白序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana，NP_177641.1)、沙梨 (Pyrus pyrifolia，BAC78212.1)、地中海柏木(Cupressus sempervirens，AAR21075.1)、煙草滲透素(Nicotiana tabacum osmotin，P14170.2)以及煙草 PR－5d(Nicotiana tabacum PR－5d，P25871.1)的相似性分別為 45%、39%、48%、67%和62%(圖3)。另外，PtPR－5前體蛋白中的信號(hào)肽為α螺旋結(jié)構(gòu)，而模擬的成熟蛋白包含17處卷曲(幾乎全部暴露在蛋白分子外側(cè))、6個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)近似排列成桶狀(全部位于蛋白內(nèi)部)、且有17個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵(圖4)。

圖4 PtPR－1、PtPR－5、PtPR－10蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹及其三維結(jié)構(gòu)模擬圖

2.1.3 PtPR－10 基因序列的分析

毛白楊PR－10基因組序列大小為574 bp包含了一個(gè)91－bp的內(nèi)含子序列(圖1)，開放閱讀框?yàn)?83 bp(HM589201)，可編碼一個(gè)分子量17.9 KD、等電點(diǎn)4.82的160aa蛋白，為酸性蛋白，包含一個(gè)Bet_v_1結(jié)構(gòu)域。經(jīng)預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)，PtPR－10蛋白序列中可能的磷酸化位點(diǎn)位于3處絲氨酸(Ser38、41、85)，4 處蘇氨酸(Thr53、58、109、121)和 4 處酪氨酸(Tyr82、102、122、139)(圖 2)。多重序列比對(duì)分析結(jié)果表明，毛白楊PR－10蛋白序列相似性一般，例如歐洲白樺(Betula pendula，CAB94733.1)46%、剛毛檉柳(Tamarix hispida，ACK38253.1)40%、加州山松(Pinus monticola，AAL49994.1)28%、蘋果(Malus domestica，AAS00053.1)32%、刺茄(Solanum virginianum，AAU00066.1)41%(圖 4)。另外，蛋白模擬結(jié)構(gòu)如圖4所示，PtPR－10主體結(jié)構(gòu)為7個(gè)β折疊、2條長(zhǎng)短不一的α螺旋和1個(gè)雙硫鍵。

2.2 PtPR－1、PtPR－5 和 PtPR－10 的誘導(dǎo)表達(dá)分析

為了研究SA、MeJA誘導(dǎo)處理對(duì)毛白楊的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化的影響，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分別對(duì)誘導(dǎo)處理不同時(shí)間后的PtPR－1、PtPR－5和PtPR－10的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，PtPR－1在SA誘導(dǎo)下初始表達(dá)水平較低，24 h后表達(dá)量顯著增加，48 h后已迅速升高約為初始水平200倍。另外，在MeJA處理下，PtPR－1呈先高后低再劇增的特征，初期PtPR－1表達(dá)量開始升高(于6 h后達(dá)到小高峰、約為初始水平100倍)，12 h后降至接近初始水平，但在隨后誘導(dǎo)24至48 h期間其表達(dá)水平劇增至約為初始水平的400倍。

與PtPR－1相比，PtPR－5無(wú)論在SA還是MeJA誘導(dǎo)下表達(dá)量均相對(duì)較低(圖5)。PtPR－5的表達(dá)受SA誘導(dǎo)影響，呈先高后低再恢復(fù)初始水平的波動(dòng)特點(diǎn);在MeJA影響下，PtPR－5表達(dá)先降低再恢復(fù)初始水平。

PtPR－10的誘導(dǎo)表達(dá)模式與 PtPR－1、PtPR－5均有所不同(圖5)。在SA作用下，PtPR－10表達(dá)量有所提高，6 h即達(dá)到最高值，隨后呈緩慢遞減趨勢(shì);而在MeJA誘導(dǎo)下，PtPR－10表達(dá)水平不斷升高，這與PtPR－1受SA誘導(dǎo)表達(dá)模式相似，但增長(zhǎng)曲線更加平緩、且增長(zhǎng)值也較小。

圖5 水楊酶、抹莉酸P酯誘導(dǎo)處理對(duì)毛白楊PR－1、PR－5和PR－10的轉(zhuǎn)錄水平變化的影響

3 討論

植物受病原菌侵染后，局部受感染部分細(xì)胞迅速凋亡，進(jìn)而激發(fā)植物體對(duì)后續(xù)病原物產(chǎn)生廣譜、持久和系統(tǒng)的抗性，即所謂的系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)[15]。SA 是植物體內(nèi)含量較低的一種內(nèi)源酚類物質(zhì)，目前已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SA是誘導(dǎo)SAR的關(guān)鍵信號(hào)分子，可抑制過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶的活性而造成H2O2的累積[16－18]。H2O2一方面作可為強(qiáng)氧化劑而能直接抵御病原菌的侵害，但對(duì)植物體自身也造成較大的毒害作用;另一方面，H2O2與活性氧的積累對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)基因的激活可起著第二信使的作用。另外，JA及其揮發(fā)性衍生物MeJA不僅影響植物體的生長(zhǎng)發(fā)育，而且也是種創(chuàng)傷誘導(dǎo)的內(nèi)源信號(hào)分子，可啟動(dòng)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)。目前已有報(bào)道，植物主要依靠SA、JA等多種信號(hào)通路間的“crosstalk”互作機(jī)制，調(diào)控包括病程相關(guān)蛋白基因在內(nèi)的大量防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，在植物基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮這重要作用[19]。

煙草PR－1蛋白相關(guān)研究證實(shí)，PR－1家族分為堿性蛋白和酸性蛋白兩種形態(tài)，其中酸性PR－1蛋白分布在細(xì)胞間隙，受SA信號(hào)通路誘導(dǎo)表達(dá);而堿性PR－1蛋白則分布在液泡中，受JA/ET信號(hào)通路誘導(dǎo)[20－24]。在本研究中，對(duì)毛白楊 PtPR－1 的 N端信號(hào)肽、C端糖基化位點(diǎn)和分子量等進(jìn)行分析，結(jié)果均顯示為典型的酸性PR－1蛋白特征，但等電點(diǎn)分析顯示為偏堿性蛋白。Ward等[25]研究后發(fā)現(xiàn)，同時(shí)施用SA和MeJA的混合物，酸性PR－1的誘導(dǎo)表達(dá)量明顯高于單獨(dú)施用SA時(shí)的水平。由此可推測(cè)，毛白楊PtPR－1可能兼具PR－1家族酸性蛋白和堿性蛋白的特點(diǎn)，在SA和MeJA處理下均受誘導(dǎo)表達(dá)。目前，眾多研究證實(shí)，NPR1(nonexpressor of pathogenesis－related genes 1)是SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作用于SA下游的關(guān)鍵性調(diào)控因子，而SA可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)發(fā)生變化，無(wú)活性的NPR1寡聚體可被還原激活為NPR1單體，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與結(jié)合在PR基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子TGA互作激活 PR－1 基因[26－30]。同時(shí)，Petersen 等[31]通過對(duì)擬南芥MAPKs通路的研究后發(fā)現(xiàn)，AtMPK4蛋白元件既可作為負(fù)調(diào)節(jié)因子下調(diào)植物體SA水平而抑制SAR，又可作為正調(diào)節(jié)因子激活JA響應(yīng)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中施用高濃度外源SA后發(fā)現(xiàn)，毛白楊體內(nèi)SA水平提高，推測(cè)可能是在NPR1介導(dǎo)下促進(jìn)了毛白楊PtPR－1的表達(dá)，而毛白楊體內(nèi)SA水平增高可造成H2O2積累及氧迸發(fā)，可能激發(fā)MAPKs通路中SA的負(fù)調(diào)控因子下調(diào)內(nèi)源SA的水平，進(jìn)而減弱了PtPR－1的表達(dá)，但同時(shí)也激活了JA響應(yīng)基因的表達(dá)。Creelman等[32]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SA－JA 在低濃度時(shí)存在協(xié)同作用，并且SA對(duì)JA的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于JA對(duì)SA的誘導(dǎo)作用;Repka等[33]研究也證實(shí)SA處理可促進(jìn)JA生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶AOS(丙二烯氧化物合酶)基因的表達(dá);Rao等[34]發(fā)現(xiàn)在臭氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中，JA能抑制SA的生物合成和氧的迸發(fā)，從而減弱由SA引起的細(xì)胞死亡。據(jù)此推測(cè)，正是在減弱和增強(qiáng)雙重作用下，本實(shí)驗(yàn)中毛白楊PtPR－1基因表達(dá)量增長(zhǎng)緩慢，但隨著SA誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，初期毛白楊對(duì)內(nèi)源SA的抑制作用趨于相對(duì)飽和，而持續(xù)高濃度的SA對(duì)PtPR－1誘導(dǎo)作用逐漸增大，同時(shí)內(nèi)源JA積累量提高或許也有助于促進(jìn)PtPR－1表達(dá)量的迅速放大。

另外，外源MeJA(50 μmol/L)能誘導(dǎo)大部分植株或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中合成SA的關(guān)鍵酶PAL的mRNA 的合成和酶活性的提高[33];但 Leon－Reyes等[35－36]對(duì)擬南芥 npr1突變體進(jìn)行比較研究后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)中的NPR1單體通過作用于JA合成途徑的下游，在SA－JA“crosstalk”中發(fā)揮拮抗作用而抑制JA響應(yīng)基因的表達(dá)。因此，MeJA脅迫處理后的毛白楊植株，在促進(jìn)PtPR－1表達(dá)同時(shí)，也可通過誘導(dǎo)SA合成酶基因PAL的表達(dá)而提高體內(nèi)SA水平，進(jìn)而發(fā)揮拮抗作用;但由于MeJA對(duì)SA的誘導(dǎo)作用相對(duì)較弱，而SA積累緩慢致使在處理初期對(duì)MeJA信號(hào)通路的拮抗作用并不顯著[32]，這可能正是本研究中PtPR－1表達(dá)量保持增長(zhǎng)趨勢(shì)的原因所在。目前，Mao等[37]研究顯示，擬南芥 WRKY62轉(zhuǎn)錄因子作用于細(xì)胞質(zhì)中NPR1的下游并且負(fù)調(diào)控JA通路應(yīng)答基因的表達(dá)，說(shuō)明其很可能參與NPR1介導(dǎo)的SA對(duì)JA信號(hào)通路的拮抗過程。由此推測(cè)認(rèn)為，初期隨著毛白楊體內(nèi)SA積累量的提高，可能使得WRKY轉(zhuǎn)錄因子及NPR1介導(dǎo)拮抗作用的增強(qiáng)而降低PtPR－1表達(dá)量;但由于外源高濃度MeJA所造成的持續(xù)誘導(dǎo)效應(yīng)強(qiáng)于內(nèi)源SA對(duì)MeJA的拮抗，最終可促進(jìn)PtPR－1表達(dá)量迅速恢復(fù)提高。

PtPR－5含有一個(gè)thaumatin保守結(jié)構(gòu)域(THN結(jié)構(gòu)域)，與奇甜蛋白具有較高同源性，屬于PR－5蛋白家族中類甜蛋白(Thaumatin－Like Protein，TLP)。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，PtPR－5至少具有8個(gè)二硫鍵，說(shuō)明其穩(wěn)定性相對(duì)較高，可對(duì)蛋白酶具有很強(qiáng)的耐受性。另外，有些研究證實(shí)，PR－5能夠直接插入真菌細(xì)胞膜形成穿孔而造成水涌入細(xì)胞引發(fā)滲透性破裂，進(jìn)而起到裂解孢子、抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的作用，表現(xiàn)出抗真菌活性[38，14]。但本研究發(fā)現(xiàn)，PtPR－5受SA和MeJA誘導(dǎo)作用并不顯著，這說(shuō)明并非所有PR－5蛋白均能發(fā)揮活性，因此，PtPR－5蛋白在響應(yīng)多種脅迫誘導(dǎo)以及植物與微生物互作中的功能有待于進(jìn)一步深入研究。

PtPR－10內(nèi)部含有一個(gè)高度保守的“P－LOOP”基序(G－x－GG－x－G－xx－K)，廣泛存在于磷酸化激酶和核酸結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域[39]，該區(qū)域的磷酸化可能與其核酸酶活性相關(guān)[40－41]。目前，從樺樹、棉花、辣椒、刺茄和花生中分離純化的PR－10均證實(shí)具有體外核酸酶活性[42－46]，而從西芹、苜蓿和馬鈴薯中分離得到的 PR－10 卻無(wú)體外核酸酶活性[47－49]。Chadha和 Das[43]研究認(rèn)為，AhPR－10 蛋白通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞后而發(fā)揮核酸酶活性降解核酸，進(jìn)而殺死病原菌;此外，PR－10所包含的Bet_v_1結(jié)構(gòu)域還能夠與細(xì)胞分裂素、脂肪酸和黃酮類物質(zhì)相結(jié)合，進(jìn)而參與類固醇激素介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)或生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控[50－51]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PtPR－10 表達(dá)量于SA處理6h后即達(dá)到最高值，而隨后呈緩慢遞減趨勢(shì);但PtPR－10表達(dá)水平卻隨著MeJA誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中PtPR－1誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，推測(cè)PtPR－10可能只響應(yīng)SA信號(hào)途徑，而不受MeJA的誘導(dǎo)。另外，蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，PR10家族的保守性不高，除了核心區(qū)域和磷酸化位點(diǎn)外，其余的氨基酸殘基變化差異很大，這可能是植物對(duì)多樣化的生物非生物脅迫的一種適應(yīng)。

綜上所述，PtPR－1可能響應(yīng)SA和JA雙重誘導(dǎo)，而PtPR－10可能只受SA誘導(dǎo)表達(dá)，PtPR－5受誘導(dǎo)表達(dá)并不顯著，說(shuō)明病程相關(guān)蛋白基因具有不同的誘導(dǎo)表達(dá)模式，體現(xiàn)了植物體內(nèi)多種信號(hào)通路調(diào)控基因表達(dá)的復(fù)雜性;而作為植物免疫系統(tǒng)效應(yīng)因子的病程相關(guān)蛋白與抗病信號(hào)通路密不可分，是探討植物抗病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。因此，開展毛白楊病程相關(guān)蛋白基因的克隆，并結(jié)合信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)對(duì)基因的功能及調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究，可為林木抗病基因工程研究奠定重要基礎(chǔ)。

[1]Antoniw J F，White R F.The effects of aspirin and polyacrylic acid on soluble leaf proteins and resistance to virus infection in five cultivars of tobacco[J].Journal of Phytopathology，1980，98(3):331－341.

[2]Van Loon L C.The nomenclature of pathogenesis-related proteins[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1990，37(5):229－230.

[3]Van Loon L C，Pierpoint W S，Boller T，et al.Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins[J].Plant Molecular Biology Reporter，1994，12(3):245－264.

[4]Van Loon L C，Rep M，Pieterse C M J.Significance of inducible defense-related proteins in infected plant[J].Annual Review of Phytopathology，2006，44(1):135－162.

[5]Van Loon L C，Van Strien E A.The families of pathogenesis－related proteins，their activities，and comparative analysis of PR-1 type proteins[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1999，55(2):85－97.

[6]Jansson S，Douglas C J.Populus:a model system for plant biology[J].Annual Review of Plant Biology，2007，58(3):435－458.

[7]Zhu Z T，Zhang Z Y.The status and advances of genetic improvement of Populus tomentosa Carr[J].Journal of Beijing Forest University(English Edition)，1997，6(1):1－7.

[8]Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al.The SWISS-MODEL Workspace:A web-based environment for protein structure homology modeling[J].Bioinformatics，2006，22(2):195－201.

[9]Guex N，Peitscn M C.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer:An environment for comparative protein modeling[J].Electrophoresis，1997，18(2):2714－2723.

[10]Schwede T，Kopp J，Guex N，et al.SWISS-MODEL:an automated protein homology-modeling server[J].Nucleic Acids Research，2003，31:3381－3385.

[11]Regier N，Streb S，Cocozza C，et al.Drought tolerance of two black poplar(Populus nigra L.)clones:contribution of carbohydrates and oxidative stress defence[J].Plant Cell Environ，2009，32(12):1724－1736.

[12]Rinaldi C，Kohler A，F(xiàn)rey P，et al.Transcript profiling of poplar leaves upon infection with compatible and incompatible strains of the foliar rust Melampsora larici-populina[J].Plant Physiology Preview，2007，144(1):347－366.

[13]Gattiker A，Gasteiger E，Bairoch A.ScanProsite:a reference implementation of a PROSITE scanning tool[J].Applied Bioinformatics，2002，1(2):107－108.

[14]Thompson C E，F(xiàn)ernandes C L，De Souza O N，et al.Molecular modeling of pathogenesis-related proteins of family 5[J].Cell Biochemistry and Biophysics，2006，44(3):385－394.

[15]Hammerschmidt R.Induced disease resistance:how do induced plants stop pathogens[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1999，55:77－84.

[16]Delaney T P，F(xiàn)riedrich L，Ryals J A.Arabidopsis signal transduction mutant defective in chemically and biologically induced disease resistance[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(4):6602－6606.

[17]Gaffney T，F(xiàn)riedrich L.Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance[J].Science，1993，261(6):754－756.

[18]Shulaev V，Leon J.Is salicylic acid a translocated signal of systemic acquired resistance in tobacco? [J].Plant Cell，1995，7(3):1691－1701.

[19]Annemart Koornneef and Corné M J Pieterse.Cross Talk in Defense Signaling[J].Plant Physiology，2008，146(3):839－844.

[20]Dixon D C，Cutt J R，Klessig D F.Differential targeting of the tobacco PR-1 pathogenesis-related proteins to the extracellular space and vacuoles of crystal idioblasts[J].EMBO Journal，1991，10:1317－1324.

[21]Eyal Y，Meller Y，Lev-Yadun S，et al.A basic-type PR-1 promoter directs ethylene responsiveness，vascular and abscission zone－specific expression[J].The Plant Journal，1993，4:225－234.

[22]Niki T，Mitsuhara I，Seo S，et al.Antagonistic effect of salicylic acid and jasmonic acid on the expression of pathogenesis-related(PR)protein genes in wounded mature tobacco leaves[J].Plant and Cell Physiology，1998，39(2):500－507.

[23]Riviere M P，Marais A，Ponchet M，et al.Silencing of acidic pathogenesis-related PR-1 genes increases extracellular β-(1→3)-glucanase activity at the onset of tobacco defence reactions[J].Journal of Experimental Botany，2008，59(6):1225－1239.

[24]Sessa G，Yang X Q，Raz V，et al.Dark induction and subcellular localization of the pathogenesis-related PRB-1b protein[J].Plant Molecular Biology，1995，28(3):537－547.

[25]Ward E R，Uknes S J，Williams S C，et al.Goordinate gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance[J].Plant Cell，1991，3(3):1085－1094.

[26]Delaney T P，Uknes S，Vemooij B，et al.A central role of salicylic acid in plant disease resistance[J].Science，1994，266(2):1247－1250.

[27]Dong X N.NPR1，all things considered[J].Current Opinion in Plant Biology，2004，7(6):547－552.

[28]Mou Z L，F(xiàn)an W H，Dong X N.Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes[J].Cell，2003，113(1):935－944.

[29]Spoel S H，Koornneef A，Claessens S M C，et al.NPR1 modulates cross－talk between salicylate-and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol[J].Plant Cell，2003，15(2):760－770.

[30]Zhang Y L，F(xiàn)an W H，Kinkema M，et al.Interaction of NPR1 with basic leucine zipper protein transcription factors that bind sequences required for salicylic acid induction of the PR-1 gene[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96:6523－6528.

[31]Petersen M，Brodersen P，Naested H，et al.Arabidopsis MAP kinase 4 negatively regulates systemic acquired resistance[J].Cell，2000，103(7):1111－1120.

[32]Creelman R A，Mullet J E.Biosynthesis and action of jasmonates in plants[J].Annual Review of Plant Biology，1997，48:355－381.

[33]Repka V，F(xiàn)ischerova I，Silharova K.Methyl Jasmonate is a potent elicitor of multiple defense responses in grapevine leaves and Cell-Suspension cultures[J].Biologia Plantarum，2004，48(2):273－283.

[34]Rao M V，Lee H，Creelman R A，et al.Jasmonic acid signaling modulates ozone-induced hypersensitive cell death[J].Plant Cell，2000，12(9):1633－1646.

[35]Leon Reyes A，Spoel S H，De Lange E S，et al.Ethylene modulates the role of nonexpressor of pathogenesis-related genes1 in cross talk between salicylate and jasmonate signaling[J].Plant Physiology，2009，149:1797－1809.

[36]Leon-Reyes A，Van der Does D，De Lange E S，et al.Salicylate-mediated suppression of jasmonate-responsive gene expression in Arabidopsis is targeted downstream of the jasmonate biosynthesis pathway[J].Planta，2010，232(6):1423－1432.

[37]Mao P，Duan M R，Wei C H，et al.WRKY62 transcription factor acts downstream of cytosolic NPR1 and negatively regulates jasmonate-responsive gene expression[J].Plant and cell physiology，2007，48:833－842.

[38]Midoro-Horiuti T，Brooks E C，Goldblum R M.Pathogenesis-related proteins of plants as allergens[J].Annals of Allergy，Asthma ＆ Immunology，2001，87(4):261－271.

[39]Saraste M，Sibbald P R，Wittinghofer A.The P-loop-a common motif in ATP-and GTP-binding proteins[J].Trends in Biochemical Science，1990，15(11):430－434.

[40]Hoffmann-Sommergruber K，Vanek-Krebitz M，Radauer C，et al.Genomic characterization of members of the Bet v 1 family:genes coding for allergens and pathogenesis-related proteins share intron positions[J].Gene，1997，197(1/2):91－100.

[41]Bantignies B，Séguin J，Muzac I，et al.Direct evidence for ribonucleolytic activity of a PR-10-like protein from white lupin roots[J].Plant molecular Biology，2000，42(6):871－881.

[42]Bufe A，Spangfort M D，Kahlert H，et al.The major birch pollen allergen，Bet v1，shows ribonuclease activity[J].Planta，1996，199(3):413－415.

[43]Chadha P，Das R H.A pathogenesis related protein，AhPR10 from peanut:an insight of its mode of antifungal activity[J].Planta，2006，225(1):213－222.

[44]Liu J J，Ekramoddoullah A K M.The family 10 of plant pathogenesis-related proteins:Their structure，regulation，and function in response to biotic and abiotic stresses[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，2006，68:3－13.

[45]Park C J，Kim K J，Shin R，et al.Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway[J].Plant Journal，2004，37(2):186－198.

[46]Zhou X J，Lu S，Xu Y H，et al.A cotton cDNA(GaPR-10)encoding a pathogenesis-related 10 protein with in vitro ribonucle-ase activity[J].Plant Science，2002，162(4):629－636.

[47]Breda C，Sallaud C，Turk J，et al.Defense reaction in Medicago sativa:a gene encoding a class 10 PR protein is expressed in vascular bundles[J].Molecular plant-microbe interactions，1996，9(8):713－719.

[48]Liu X J，Huang B B，Lin J，et al.A novel pathogenesis-related protein(SsPR10)from Solanum surattense with ribonucleolytic and antimicrobial activity is stress-and pathogen-inducible[J].Journal of Plant Physiology，2006，163(5):546－556.

[49]Matton D P，Brisson N.Cloning，expression，and sequence conservation of pathogenesis-related gene transcripts of potato[J].Molecular plant-microbe interactions，1989，6(2):325－331.

[50]Koistinen K M，Soininen P，Venalainen T，et al.Birch PR-10c interacts with several biologically important ligands[J].Phytochemistry，2005，66(21):2524－2533.

[51]Mogensen J E，Wimmer R，Larsen J N，et al.The major birch allergen，Bet v1，shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277(26):23684－23692.