關(guān)洪全 高 原 王素娟 王 哲 馬賢德 趙金茹 王守巖 柴繼嚴(yán) 王 健

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織TNF-α表達(dá)的影響

關(guān)洪全 高 原 王素娟 王 哲 馬賢德 趙金茹 王守巖 柴繼嚴(yán) 王 健

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

目的 觀察眼針對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白表達(dá)的影響，以探討眼針對缺血再灌注大鼠腦海馬區(qū)細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法 健康SD大鼠，雌雄不拘，設(shè)正常對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針組;采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，選取眼穴肝區(qū)、腎區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)，平刺，進(jìn)針3 mm，留針20 min;分別于腦缺血再灌注后3、24、72 h處死動物并取材;應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡)檢測海馬組織中TNF-α蛋白的表達(dá)。結(jié)果 眼針組海馬組織TNF-α在腦缺血再灌注后3、24、72 h均較模型組明顯降低，差異顯著。結(jié)論 眼針療法可以降低腦缺血再灌注模型大鼠海馬組織TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而抑制由腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

眼針;缺血再灌注;腫瘤壞死因子-α;海馬

眼針療法是遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院彭靜山老先生發(fā)明的一種針刺療法，臨床應(yīng)用多年，對缺血性腦卒中等疾病具有很好的療效，但其機(jī)制尚未闡明。腦缺血再灌注損傷主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、鈣超載、腦水腫和細(xì)胞凋亡等有關(guān)。炎性反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有廣泛生物學(xué)功能的炎癥介質(zhì)，在腦組織缺血再灌注后引起的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等組織損傷中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。本研究通過觀察眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦海馬組織勻漿中TNF-α蛋白表達(dá)的影響，探討其腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康SD大鼠96只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由飲水、攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針組，再根據(jù)缺血再灌注損傷時(shí)間分設(shè)3 h、24 h、72 h亞組，每亞組8只。

1.2 模型制備與評價(jià) 模型組及眼針組采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，模型制作按照文獻(xiàn)〔4〕記載方法進(jìn)行。模型成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠于缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)〔5〕:0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型組、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1 cm，其他同手術(shù)組。正常組未處理。

1.3 眼針取穴及刺法 眼針組:用31號13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法〔6〕，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法:平刺，進(jìn)針3 mm。留針10 min時(shí)用刮柄進(jìn)行刮針1次，刮針5下。治療時(shí)間:3 h針刺組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30 min，分別進(jìn)行眼針治療;24 h、72 h針刺組于腦缺血再灌注即刻及其取材前30 min分別進(jìn)行眼針治療，除此之外每12 h針刺1次。見圖1。

圖1 大鼠眼針取穴示意圖

1.4 試劑及實(shí)驗(yàn)用藥 親和純化兔抗鼠TNF-α多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 檢測方法 海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)(Western印跡法)檢測:分別于缺血再灌注損傷3 h、24 h、72 h給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側(cè)海馬，按海馬組織凈重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，pH7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。兔抗鼠TNF-α 一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 顯色;掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，采用方差分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時(shí)左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等;假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。與模型組比較，眼針組再灌注損傷3 h、24 h、72 h后神經(jīng)功能缺損評分均有差異(P＜0.01)。見表1。

表1 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s，n=8)

表1 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別3 h 24 h 72 h模型組2.625±0.916 1 3.125±0.640 9 2.625±0.744 0眼針組 1.500±0.534 51)1.500±0.534 51)1.625±0.517 51)

2.2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響 采用Western印跡方法檢測大鼠右側(cè)海馬TNF-α蛋白，以β-αctin為內(nèi)參，模型組TNF-α蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常組和假手術(shù)組，眼針組表達(dá)明顯低于模型組，均有顯著差異(P＜0.05)。見圖2、表2。

表2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響(±s，n=8)

表2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別3 h 24 h 72 h正常組0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3 0.564 8±0.033 3假手術(shù)組 0.694 5±0.083 8 0.686 3±0.030 0 0.616 7±0.042 6模型組 1.039 4±0.065 71)1.086 8±0.037 61)1.120 8±0.040 01)眼針組 0.843 2±0.052 92)0.766 9±0.035 22)0.711 9±0.032 72)

圖2 眼針對大鼠腦缺血再灌注損傷不同時(shí)間點(diǎn)海馬TNF-α蛋白表達(dá)的影響

3 討論

TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。研究表明，有許多種促炎細(xì)胞因子在腦缺血損傷后高度表達(dá)，TNF-α是較早釋放的具有多種生物效應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮級聯(lián)放大反應(yīng)的作用，可以激活細(xì)胞因子誘導(dǎo)白介素和次級炎癥介質(zhì)的合成。腦缺血再灌注后，TNF-α在損傷區(qū)域大量表達(dá)，除循環(huán)性巨噬細(xì)胞外，缺血神經(jīng)組織內(nèi)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞亦是TNF-α的重要來源，TNF-α在腦組織中高表達(dá)具有神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡〔7〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬組織僅見少量TNF-α表達(dá)，說明TNF-α在正常海馬組織中低含量存在，可能與神經(jīng)細(xì)胞的正常維護(hù)有關(guān)。模型組大鼠海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)在缺血再灌注3 h開始升高，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，24 h明顯升高，72 h升高達(dá)高峰，表明腦缺血再灌注后72 h內(nèi)，缺血海馬組織的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α隨著時(shí)間的延長而逐漸增多，導(dǎo)致海馬組織的缺血性損傷，且TNF-α的表達(dá)與海馬組織的損傷程度呈正相關(guān)。給予眼針治療后，大鼠海馬組織TNF-α蛋白表達(dá)明顯下降，說明眼針在海馬組織缺血再灌注中能夠抑制TNF-α的表達(dá)，減輕其對腦組織的損傷。

眼針是在眼眶周圍針刺以治療全身疾病的一種微針技術(shù)，是針灸施術(shù)的一種特殊針法。中醫(yī)認(rèn)為，腦為奇恒之府，腦由髓匯集而成，故名“髓?！?，腦是精髓和神明高度匯集之處，有元神之府。眼與腦密切相連。……目形類丸，……內(nèi)有大絡(luò)六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一;中絡(luò)八，謂膽、胃，大小腸，三焦、膀胱各主其一;外有旁支細(xì)絡(luò)莫知其數(shù)，皆懸貫于腦……〔8〕。說明眼通過經(jīng)絡(luò)與腦密切相連?！拔迮K六腑之精氣，皆上注于目，而為之晴。精之窠為眼……其窠氣之精為白眼，肌肉之精為約束。裹擷筋骨血?dú)庵?，而與脈并為系，上屬于腦，后出于項(xiàng)中，故邪入于項(xiàng)，因逢其身之虛，其入深，則隨目系以入腦”〔9〕?！鞍死獞?yīng)乎八卦，脈絡(luò)經(jīng)緯于腦，貫通臟腑，以達(dá)血?dú)?，往來以滋于目”。說明眼與腦通過經(jīng)絡(luò)密切相連，生理上相互協(xié)調(diào)，病理上也是病邪傳變的途徑。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性中風(fēng)是由于年老體虛，臟腑功能減退，氣血運(yùn)行不暢，淤血阻滯腦部絡(luò)脈所致。刺針眼穴肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)，具有醒神開竅、活血通絡(luò)作用。本實(shí)驗(yàn)證明，針刺上述穴位可通過直接抑制缺血性腦損傷大鼠海馬組織TNF-α蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對腦細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 丁德光，李家康，羅惠平，等.電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)TNF-α mRNΑ 表達(dá)及TNF-α 含量影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2007;16(6):695-7.

2 Rodríguez-Yáňez M，Castillo J.Role of inflammatory markers in brain ischemia〔J〕.CurrOp in Neurol，2008;21(3):353-7.

3 Schaller B，Graf R.Cerebral ischemia and reperfusion:the pathophysiologic concept αs α basis for clinical therapy〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2004;24(2):351-71.

4 馬賢德，孫宏偉.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009;27(6):1200-1.

5 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

6 彭靜山.眼針療法〔M〕.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1990:11.

7 李丹萍，易 莉，陳 強(qiáng)，等.針刺對腦缺血損傷級聯(lián)反應(yīng)和再灌注影響的研究進(jìn)展〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2005;20(11):865-7.

8 王肯堂.證治準(zhǔn)繩〔M〕.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1997:226.

9 程士德.內(nèi)經(jīng)講義·靈樞·大惑論〔M〕.上海:上?？萍汲霭嫔?，1984:56.

〔2011-03-17收稿 2011-06-15修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)

The effect of eye acupuncture therapy on the expression of TNF-α of hippocampus at different time points in rats with cerebral ischemia reperfusion

GUAN Hong-Quan，GAO Yuan，WANG Su-Juan，et al.
Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

Objective To investigate TNF-α expression at different time points in the brain of rats with cerebral ischemia-reperfusion(IR)injury，in order to discuss the mechanism of eye-acupuncture therapy and observe the intervention effects on the hippocampus.Methods Healthy SD rats，male and female，were randomly divided into normal，sham-operated control，model and eye-acupuncture groups.Sham-operated control，model and eye-acupuncture groups were divided into 3，24 and 72 h subgroups.The rat model of cerebral IR was established by suture method.Eye acupoint liver area，kidney area，upper jiao area and lower jiao area were selected and acupunctured horizontally，inserting needle in 3 mm deep，retaining needle for 20 min.All the animals were executed respectively at 3，24，72 h after reperfusion and draw materials.The method of immunohistochemistry and Western blot technology were taken to detect the changes of hippocampus TNF-α expression in rats after the eye-acupuncture therapy.Results Compared with that of model group，TNF-α expression in the hippocampus of rats of the eye-acupuncture group was significantly decreased obviously at 3，24，72 h after reperfusion.Conclusions The eye-acupuncture therapy could down-regulate hippocampus TNF-α expression in rats with cerebral IR injury，suppress inflammatory response induced by cerebral IR and play a role in protecting brain.

Eye acupuncture;Ischemia-reperfusion;Tumor necrosis factor-α;Hippocampus

R74

A

1005-9202(2012)17-3705-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.043

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007CB512702)

王 健(1948-)，男，主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療缺血性腦血管病研究。

關(guān)洪全(1954-)，男，教授，主要從事中醫(yī)藥對免疫的調(diào)控研究。