裴嘉博，李曉艷，李亞東

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

從不同組織和器官中提取純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行Northern分析、實(shí)時(shí)定量PCR、cDNA文庫構(gòu)建和新一代測(cè)序（如454 pyrosequencing和Illumina sequencing）等許多分子生物學(xué)研究的必要前提。但是由于植物種類繁多，次生代謝物質(zhì)復(fù)雜，導(dǎo)致很難有一種通用的方法來提取不同植物組織中的RNA。尤其是許多植物果實(shí)組織中富含多糖和酚類化合物，而且RNAase（核糖核酸酶）水平較高，這些因素使得從果實(shí)中提取高質(zhì)量RNA十分困難[1-3]。目前已經(jīng)從葡萄[4]、獼猴桃[5]、香蕉[6]、蘋果[5]和柿[7]等的果實(shí)中提取到高質(zhì)量的RNA，但以越橘（Vaccinium corymbosum L.）果實(shí)為材料進(jìn)行RNA提取的文章尚未見報(bào)道。

越橘果實(shí)富含多糖多酚，尤其是花色素苷的含量在眾多水果和蔬菜當(dāng)中高居榜首[8-9]。對(duì)越橘花色素苷合成途徑的一些關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆分離及通過實(shí)時(shí)定量PCR研究其在不同組織中表達(dá)的特異性，是了解越橘花色素苷合成分子機(jī)制的主要方法，而提取高質(zhì)量的RNA是這一系列后續(xù)試驗(yàn)的前提和基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以越橘成熟果的果肉和果皮為試材，采用市售經(jīng)典的適合多糖多酚植物RNA提取試劑盒、Trizol試劑法和改良的CTAB法提取越橘果實(shí)組織總RNA。以探索和研究最適于越橘果實(shí)的總RNA的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以越橘品種北陸為試材，來源于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小漿果試驗(yàn)基地。成熟果實(shí)（花后50 d）采收后快速將果肉和果皮剝離，并分別置于液氮中速凍，于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 果實(shí)總RNA的提取

試驗(yàn)所用到的研缽、缽杵、鑷子、藥匙在使用前于180℃烘箱干熱滅菌6 h，離心管和各種移液器吸頭等塑料器材使用前用0.1%（V/V）的DEPC水（Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯） 37℃浸泡12 h，高壓滅菌后使用。試劑均用0.1%DEPC水配制，高壓滅菌后使用。本試驗(yàn)選用的試劑盒都是目前市場(chǎng)反映較好的能從多種植物組織中，特別是從富含多糖多酚的果實(shí)中提取RNA的產(chǎn)品（見表1）。試劑盒的操作均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，每種試劑盒至少重復(fù)3次。改良的CTAB法，此法是參照J(rèn)aakola等報(bào)道的從越橘屬植物歐洲越橘（Bilberry）果實(shí)中提取RNA的方法并略加改動(dòng)[10]。

表1 6種不同的RNA提取方法Table1 Six different methods of RNA isolation

主要試劑：

CTAB提取緩沖液：2%CTAB；2%PVP（W/V）（Polyvinylpyrrolidone，分子質(zhì)量360 000，聚乙烯吡咯烷酮，分子質(zhì)量360 000）；100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）；25 mmol·L-1EDTA；2.0 mol·L-1NaCl；0.5 g·L-1亞精胺（Spermidine）。

SSTE緩沖液：1.0 mol·L-1NaCl；0.5%SDS（W/V）；10 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）；1 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）。

具體步驟如下：

①65℃水浴10 mL CTAB提取緩沖液，在使用前加入2%（V/V）β-巰基乙醇。

②從-80℃冰箱中取出材料置于液氮預(yù)冷過的研缽中，加入適量液氮充分研磨樣品，液氮揮發(fā)后將樣品迅速移入預(yù)冷的10個(gè)1.5 mL離心管中，每管0.1 g，冰上操作。

③加1 mL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，渦旋混勻，65℃水浴10 min，其間震蕩離心管2～3次，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。

④取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用等體積的氯仿∶異戊醇＝24∶1（V/V）抽提2次，每次充分震蕩，放置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。

⑤將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/4體積 10 mol·L-1LiCl，輕輕混勻，4 ℃冰上 6～8 h（或-20℃過夜）沉降RNA。

⑥ 4 ℃，13 000 r·min-1離心20 min。

⑦慢慢倒去上清液，將離心管倒扣在吸水紙上數(shù)分鐘。

⑧加500 mL 70%冰冷乙醇洗滌沉淀（小球狀沉淀）2次，短暫離心并慢慢倒掉乙醇。如果有色素可以重復(fù)多次清洗，直至色素去除。

⑨用100 mL SSTE緩沖液溶解RNA沉淀，如果溶解較慢，適當(dāng)進(jìn)行65℃水浴以加速RNA的溶解。將10個(gè)離心管中的溶液合并成2管。

⑩ 用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1（V/V）及等體積的氯仿∶異戊醇＝24∶1各抽提1次，每次充分震蕩，放置10 min，4℃，12 000 r·min-1離心10 min。

?取上清液，加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃沉降2 h（或-80℃沉降30 min）。

?4 ℃，13 000 r·min-1離心20 min。棄掉上清，沉淀用500 mL 70%冰冷乙醇洗滌2次，真空干燥后溶于50 mL DEPC水中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA完整性與質(zhì)量檢測(cè)

用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的總RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。使用NanoDrop 2000對(duì)樣品RNA的濃度和純度進(jìn)行定量分析。

1.4 RT-PCR驗(yàn)證

越橘果肉和果皮提取的總RNA，用DNaseⅠ（RNase free）消化基因組DNA后，各取1 μg為模板，用 M-MuLV First cDNA Synthesis Kit（Promega）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈備用。根據(jù)越橘轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（以果肉和果皮為材料進(jìn)行Illumina/Solexa測(cè)序，產(chǎn)生兩個(gè)文庫后進(jìn)行差異比較分析，得到在果皮中高表達(dá)的unigenes，數(shù)據(jù)上傳至NCBI Short Read Archive數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)：SRA046311）產(chǎn)生的在果皮中高表達(dá)的序列Unigene23486（440 bp），通過ClustalX多重比對(duì)確定其保守區(qū)，用Primer version5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物CHSUnigene23486-F：5'GACCG TCGAGGAAGTCAGGA 3'和 CHSUnigene23486-R：5'GCCTTCACAGCAGCCTCTTT 3'，以cDNA為模板，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為440 bp左右。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，55℃45 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA樣品完整性分析

通過幾種方法的反復(fù)摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有改良的CTAB法和百泰克試劑盒都能從越橘的果肉和果皮組織中提取RNA。從瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的膠片圖上可以看出（見圖1），改良的CTAB法和百泰克試劑盒所提取的越橘果肉和果皮總RNA呈現(xiàn)兩條帶，條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明提取的總RNA完整性好，純度高。

圖1 改良的CTAB法和百泰克試劑盒提取的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA isolated by improved CTAB and BioTeke kit

2.2 RNA樣品純度和產(chǎn)率檢測(cè)

對(duì)于純RNA樣品，A260/A280比值應(yīng)為1.7～2.0，A260/A230比值應(yīng)大于2.0[11]。A260/A280＞1.8說明RNA純度較好，A260/A280＜1.7說明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚類等其他有機(jī)物的污染；A260/A230＞2.2說明RNA已經(jīng)被水解成單核酸，A260/A230＜2.0說明RNA樣品中可能存在萜類化合物等次生代謝物的干擾。

使用NanoDrop 2000對(duì)RNA樣品的濃度和純度進(jìn)行定量分析表明（見表2），百泰克試劑盒提取的總RNA的A260/A280比值在1.9～2.1之間，A260/A230比值在1.5～2.0之間。這可能是由于越橘果實(shí)中含有大量的多糖、多酚類等次生代謝物質(zhì)，百泰克試劑盒法無法有效地去除干擾物質(zhì)的影響，發(fā)生輕微的水解現(xiàn)象。改良的CTAB法提取的總RNA的A260/A280的比值在1.9～2.1 之間，A260/A230的比值在2.0～2.2之間。可見，本試驗(yàn)中改良的CTAB法提取的總RNA樣品純度較好，既沒有蛋白質(zhì)及其他干擾物質(zhì)污染，也沒有被水解成單核酸。從RNA濃度和產(chǎn)率來看，百泰克試劑盒提取的總RNA濃度和產(chǎn)率均低于改良的CTAB法。植物RNAout、Tiangen試劑盒、Tiangen試劑和Trizol試劑法都沒有從越橘果實(shí)中提取出RNA，根據(jù)A260/A280和A260/A230兩個(gè)比值不難看出，這些方法都存在蛋白質(zhì)、酚類以及一些次級(jí)代謝物的干擾，進(jìn)一步說明這些方法不能夠克服越橘成熟果實(shí)中多糖和酚類等次級(jí)代謝物質(zhì)的干擾。

表2 6種方法提取的越橘果實(shí)總RNA的純度與產(chǎn)率比較Table2 Comparison of total RNA purity and yield in different tissues of blueberry fruit by six isolation methods

2.3 RT-PCR驗(yàn)證

以百泰克試劑盒和改良的CTAB法所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板擴(kuò)增由Illumina/Solexa測(cè)序產(chǎn)生的CHSUnigene23486基因片段。從圖2中可以看到，在果肉中沒有擴(kuò)增得到目的片段，而在果皮中得到一個(gè)440 bp左右的片段，由于CHSUnigene23486片段是由Ilumina/Solexa測(cè)序產(chǎn)生的在果皮中特異表達(dá)的序列，所以在果肉中沒有檢測(cè)到CHSUnigene23486，試驗(yàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。同時(shí)也說明用百泰克試劑盒和改良的CTAB法所提取的總RNA能夠滿足RT-PCR等以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究。

圖2 越橘果肉和果皮CHSUnigene23486基因片段的RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of a CHSUnigene23486 fragment by RT-PCR from blueberry pulp and skin

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，①改良的CTAB法和百泰克試劑盒法都能夠完成越橘果實(shí)總RNA的提取，而從兩種方法所獲得的總RNA樣品的純度和產(chǎn)量上看，改良的CTAB法優(yōu)于百泰克試劑盒法。從提取的成本上看，百泰克試劑盒要明顯高于CTAB法。而其他4種方法均不適合越橘果實(shí)總RNA的提取。②越橘果實(shí)中總RNA產(chǎn)率低。原因是越橘果實(shí)皮薄、柔軟多汁特點(diǎn)造成果皮和果肉極難分離，在取樣過程中RNA易發(fā)生降解，或者是越橘果實(shí)自身RNA含量較低。也可能是由于越橘果實(shí)中富含多糖和酚類（如原花色素和花色素等）物質(zhì)，酚類物質(zhì)極易被氧化并能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間相關(guān)性不大，主要是與酚的種類有關(guān)，聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物[12]。

為解決酚類化合物的干擾，在提取緩沖液中加入較高濃度的PVP（2%）和β-巰基乙醇（2%），不僅能有效地去除果實(shí)中的酚類物質(zhì)和多糖，還能去除一些色素物質(zhì)提高RNA的完整性和純度。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將其分開，在高濃度Na+或K+離子存在的條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖。Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖[13]。本試驗(yàn)提取緩沖液中NaCl濃度增大到2.0 mol·L-1，增加苯酚和氯仿的抽提次數(shù)，能夠去除多糖的干擾。另外，通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中[14]。

針對(duì)越橘果實(shí)RNA濃度低、產(chǎn)率低的特點(diǎn)，在CTAB法提取的過程中，采取加大樣品的提取量，適當(dāng)增加苯酚、氯仿抽提次數(shù)，在用SSTE溶解RNA沉淀后，將10個(gè)離心管中的溶液合并成2管，增加了RNA的濃度。本試驗(yàn)中百泰克試劑盒提取的RNA得率低，采取用真空冷凍干燥法將幾次提取的RNA濃縮后增加其濃度，但是試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA降解嚴(yán)重。雖然經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的摸索找到了適合越橘果實(shí)總RNA提取方法，即改良的CTAB法，提取的RNA能夠滿足RT-PCR等以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究，但相對(duì)于其他植物，該方法提取的RNA樣品得率仍低且耗時(shí)。因此，在今后的研究中還有待于進(jìn)一步優(yōu)化和完善。

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