王亞平，董瑞華，劉澤源，胡 園，劉皈陽（. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院藥劑藥理科，北京 0007；2. 河北北方學院，河北 張家口 075000；. 軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院臨床藥理室，北京 0007；.解放軍總醫(yī)院臨床藥理室，北京 0085）

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用。CYP450可受多種因素的影響，尤其是藥物，并引起自身或其他藥物的藥代動力學改變，使得藥效增強（中毒）或減弱（無效），從而導致藥物-藥物相互作用[1]。

近年來有關(guān)中藥活性成分對CYP450酶系影響的研究備受關(guān)注[2-3]。齊墩果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，存在于多種藥用植物中，具有多種生物學活性，如保肝、抗炎、抗腫瘤、抗HIV等[4-5]。我們的前期實驗結(jié)果表明，齊墩果酸不經(jīng)過CYP450酶代謝，而CYP450酶參與了熊果酸的代謝[6]。本文以此為基礎(chǔ)，以人肝微粒體溫孵系統(tǒng)為模型，進一步對比研究齊墩果酸和熊果酸對CYP450酶的抑制作用，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100 高效液相色譜儀，包括G1311A 四元泵，G1316A 柱溫箱，G1329A 自動進樣器，G1379A在線脫氣機，G1314A VWD 可變波長紫外檢測器，G1321A FLD 熒光檢測器和HP 色譜工作站；色譜柱Krosmail 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）購自迪馬科技公司；高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

齊墩果酸、熊果酸、非那西丁、雙氯芬酸鈉、右美沙芬氫溴酸鹽、氯唑沙宗、S-美芬妥英、香豆素、呋拉茶堿、8-甲氧補骨脂素、槲皮素、磺胺苯吡唑、奎尼丁、克拉霉素、氯美噻唑、D-葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、氧化性輔酶Ⅱ（NADP+）均購自Sigma公司；咪達唑侖注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；混合人肝微粒體（15例）（美國BD公司）；其余試劑為色譜純或分析純。

1.2 齊墩果酸和熊果酸對CYP亞型的抑制作用

200 μL孵育體系包括磷酸鉀緩沖液（pH = 7.4，100 mmol·L-1）；NADPH 生成體系（1 mmol·L-1NADP+，10 mmol·L-1葡萄糖-6-磷酸，1 U·mL-1葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，4 mmol·L-1MgCl2）；肝微粒體（0.5 mg·mL-1）和底物。

在孵育體系加入NADPH生成體系前，加入CYP探針藥物和齊墩果酸或熊果酸 50 μmol·L-1，并以CYP探針藥物的特異性抑制劑作為陽性對照，考察齊墩果酸或熊果酸對CYP各亞型的抑制作用。8種CYP亞型探針底物及其濃度分別為：非那西?。?0 μmol·L-1，CYP1A2）；香豆素（1.0 μmol·L-1, CYP2A6）；紫杉醇（10 μmol·L-1, CYP2C8）；雙氯芬酸（10 μmol·L-1，CYP2C9）；右美沙芬（25 μmol·L-1，CYP2D6）；氯唑沙宗（120 μmol·L-1，CYP2E1）；咪達唑侖（10 μmol·L-1，CYP3A4）；S-美芬妥英（10 μmol·L-1，CYP2C19）。CYP各亞型的抑制劑及其對應(yīng)的濃度分別為：呋拉茶堿（10 μmol·L-1，CYP1A2）；8-甲氧補骨脂素（2.5 μmol·L-1，CYP2A6）；槲皮素（20 μmol·L-1，CYP2C8）；磺胺苯吡唑（10 μmol·L-1，CYP2C9）；奎尼?。?0 μmol·L-1，CYP2D6）；克拉霉素（10 μmol·L-1，CYP3A4）；氯美噻唑（50 μmol·L-1，CYP2E1）；奧美拉唑（10 μmol·L-1，CYP2C19）。37 ℃預(yù)孵育3 min后，加入NADPH生成體系起始反應(yīng)，孵育一定時間后，加入100 μL甲醇或乙腈終止反應(yīng)。然后4 ℃，20 000×g離心10 min，取上清液20 μL進行HPLC分析。呋拉茶堿、8-甲氧補骨脂素是基于機理的抑制劑[7-9]，所以它與人肝微粒體、緩沖液和NADPH產(chǎn)生體系在37 ℃孵育20 min后，加入探針底物起始反應(yīng)，后續(xù)操作同上。探針底物及其產(chǎn)物的檢測參考文獻[10-11]，所有孵育樣品均做復管，結(jié)果取平均值。

為確定齊墩果酸和熊果酸是否為CYP基于機理的抑制劑，進行NADPH-時間依賴性的抑制實驗。齊墩果酸或熊果酸（50 μmol·L-1）和NADPH產(chǎn)生體系、人肝微粒體孵育一定時間（0，5，10，15 min），加入相對應(yīng)的底物起始反應(yīng)，并測定活性。

1.3 齊墩果酸對CYP3A4抑制常數(shù)的測定

固定人肝微粒體蛋白濃度為0.5 mg·mL-1，孵育時間為30 min，咪達唑侖的終濃度選擇10，25，50，100 μmol·L-1，作為抑制劑的齊墩果酸終濃度選擇10，25，50，100 μmol·L-1。

使用Dixon作圖法和Lineweaver-Burk作圖法來確定抑制反應(yīng)的類型，以Lineweaver-Burk作圖所得斜率同齊墩果酸濃度的二次作圖求得齊墩果酸的抑制動力學常數(shù)Ki。

2 結(jié)果

2.1 齊墩果酸和熊果酸對CYP亞型的抑制作用

齊墩果酸和熊果酸對CYP450酶活性的抑制作用結(jié)果見圖1，在考察的8種CYP亞型當中，齊墩果酸對CYP3A4的活性抑制作用最強，抑制率接近50%，CYP1A2次之，對其他幾種酶的活性抑制率都在30%以下，不具有統(tǒng)計學意義。熊果酸對8種酶的活性抑制率均小于20%，沒有統(tǒng)計學意義。為了測定齊墩果酸和熊果酸對CYP各個亞型基于機理抑制作用的活性，進行了NADPH-時間依賴性的抑制試驗。對所測定的CYP亞型，均沒有發(fā)現(xiàn)NADPH-時間依賴性的抑制表現(xiàn)。

圖1 齊墩果酸和熊果酸對CYP450酶活性的抑制率Fig 1 The inhibition ratio of oleanolic acid and ursolic acid on cytochromes P450

2.2 齊墩果酸對CYP3A4抑制常數(shù)的測定

根據(jù)抑制實驗的結(jié)果（圖1），齊墩果酸對CYP3A4酶的活性抑制超過了50%，因此我們進一步實驗計算半數(shù)抑制濃度（IC50）和抑制常數(shù)（Ki）。齊墩果酸對CYP3A4催化咪達唑侖羥化反應(yīng)的抑制程度隨濃度增加而增強，在100 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，其IC50值為（35.0±5.0） μmol·L-1（圖2）。依據(jù)上述實驗結(jié)果，我們進行了不同濃度的齊墩果酸對不同濃度的咪達唑侖羥化反應(yīng)抑制效果的實驗，所得到的數(shù)據(jù)用Dixon 和Lineweaver-Burk 作圖處理（圖3和圖4）。由圖可知，齊墩果酸對咪達唑侖代謝的抑制符合混合動力學行為，用Lineweaver-Burk作圖所得斜率與齊墩果酸濃度二次作圖求得齊墩果酸的抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1（圖5）。

圖2 齊墩果酸對咪達唑侖羥化活性的抑制Fig 2 Inhibition effect of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

圖3 齊墩果酸對咪達唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Dixon作圖Fig 3 Dixon plot of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation activity

圖4 齊墩果酸對咪達唑侖羥化活性抑制效應(yīng)的Lineweaver-Burk 作圖Fig 4 Lineweaver-Burk plots of inhibitory effects of oleanolic acid on midazolam hydroxylation acticity

圖5 Lineweaver-Burk作圖得到的斜率與齊墩果酸濃度的二次作圖Fig 5 Second plot of slopes from Lineweaver-Burk plot vs oleanolic acid concentrations

3 討論

本文對比研究了齊墩果酸和熊果酸對8種主要CYP亞型的抑制效果。初步篩選結(jié)果表明熊果酸對CYP450酶的活性沒有表現(xiàn)出明顯的抑制，齊墩果酸對CYP1A2的活性有輕微的抑制作用，對CYP3A4活性有明顯的抑制，在基于機理抑制的實驗中，沒有觀察到NADPH-時間依賴性的抑制，排除了兩者對CYP基于機理抑制的可能性。我們進一步研究齊墩果酸對CYP3A4酶的抑制常數(shù)，發(fā)現(xiàn)齊墩果酸可競爭性抑制CYP3A4探針藥物咪達唑侖羥化反應(yīng)的活性，并測得抑制常數(shù)Ki為39.2 μmol·L-1。由于CYP3A4酶是人體內(nèi)一類非常重要的CYP代謝酶，臨床半數(shù)以上的藥物都要經(jīng)它代謝轉(zhuǎn)化[12]，而且許多藥物也是它的誘導或抑制劑，所以齊墩果酸對CYP3A4酶的抑制作用應(yīng)引起我們的注意。

鑒于齊墩果酸和熊果酸是同分異構(gòu)體，我們可以從結(jié)構(gòu)上推測導致兩者對CYP450酶抑制作用不同的原因。齊墩果酸和熊果酸的藥理活性基團，比如羥基、雙鍵和羧基的位置都一致[13]，兩者的區(qū)別僅在于E環(huán)的甲基異構(gòu)，齊墩果酸的E環(huán)上兩個甲基取代都在20位C上，而熊果酸的E環(huán)上19位和20位上各有一個甲基，結(jié)合實驗結(jié)果我們可以推測E環(huán)甲基取代位置可能是影響對CYP抑制效果的主要因素，至于結(jié)構(gòu)差異和抑制作用之間的關(guān)聯(lián)程度需要進一步研究。

[1] Shapiro LE, Shear NH. Drug interactions/P450[J]. Curr Probl Dermatol, 2001, 13(3): 141-152.

[2] Wang X, Cheung CM, Lee WY,et al. Major tanshinones of Danshen (Salvia miltiorrhiza) exhibit different modes of inhibition on human CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 and CYP3A4 activities in vitro[J]. Phytomedicine, 2010, 17(11): 868-875.

[3] Xia CH, Sun JG, Wang GJ,et al. Herb-drug interactions: in vivo and in vitro effect of Shenmai injection, a herbal preparation, on the metabolic activities of hepatic cytochrome P450 3A1/2, 2C6,1A2, and 2E1 in rats[J]. Planta Med, 2010, 76(3): 245-250.

[4] 王奇，蘆柏震. 齊墩果酸的研究進展[J]. 中國藥房，2008，19（9）：711-712.

[5] 王鵬，張忠義，吳忠. 熊果酸在藥用植物中的分布及藥理作用[J]. 中藥材，2000，23（11）：717-722.

[6] 王亞平，胡園，董瑞華，等. 齊墩果酸和熊果酸的人肝微粒體代謝研究[J]. 軍事醫(yī)學，2012， 36（5）：368-371.

[7] Bjornsson TD, Callaghan JT, Einolf HJ,et al. The conduct of in vitro and in vivo drug-drug interaction studies: a PhRMA perspective[J]. J Clin Pharmacol, 2003, 43(5): 443-469.

[8] Huang SM, Temple R, Throckmorton DC,et al. Drug interaction studies: study design, data analysis, and implications for dosing and labeling[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007, 81(2): 298-304.

[9] Harris JW, Rahman A, Kim BR,et al. Metabolism of taxol by human hepatic microsomes and liver slices: participation of cytochrome P450 3A4 and an unknown P450 enzyme[J]. Cancer Res, 1994, 54(15): 4026-4035.

[10] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（二部）[S]. 2010年版.北京: 中國醫(yī)藥科技出版社，2010：537-538.

[11] 張江偉. 藥物代謝穩(wěn)定性和藥物相互作用的體外研究方法及其應(yīng)用[C]. 北京：中國科學院研究生院，2008：43-68.

[12] Seripa D, Pilotto A, Panza F,et al. Pharmacogenetics of cytochrome P450 (CYP) in the elderly[J]. Ageing Res Rev, 2010,9(4): 457-474.

[13] 劉丹，孟艷秋，趙娟. 齊墩果酸和熊果酸結(jié)構(gòu)修飾物的藥理活性和構(gòu)效關(guān)系研究進展[J]. 化學通報，2007，1：14-20.