周 敏，談偉君，龐雅琴，李 陽(yáng)

（1.廣西右江民族醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣西百色533000；2.廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，廣州510060）

鋅、錳是機(jī)體必需的微量元素，參與體內(nèi)多種酶的構(gòu)成，在清除自由基方面有重要作用［1－3］。作者前期研究證明鋅、錳在體外有一定的拮抗二氧化硅（SiO2）粉塵致細(xì)胞DNA損傷作用［4－5］。本文采用溴化乙錠（EB）熒光法測(cè)定DNA交聯(lián)作用，進(jìn)一步探討葡萄糖酸鋅（ZnG）、氯化錳（MnCl2）單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（Chinese hamster fibroblast cell line，CHL）的損傷作用，并尋找二者的最佳劑量組合。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)準(zhǔn)SiO2粉塵（中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，游離SiO2的含量大于97%，粉塵粒徑小于5μm占95%）；CHL系購(gòu)自上海細(xì)胞研究所；ZnG（廣東制藥廠生產(chǎn)的ZnG片）；MnCl2（上海金山興塔美興化工廠生產(chǎn)的分析純）；RPMI1640培養(yǎng)液；消化緩沖液：10mmol／L三羥甲基氨基甲烷（Tris），25 mmol／L乙 二 胺 四 乙 酸 （EDTA），100mmol／L NaCl，pH＝7.9，10%十二烷基磺酸鈉（SDS），0.1mg／mL蛋白酶 K（臨用前加）；EB緩沖液：20mmol／L K2HPO4，2mmol／L EDTA，1 μg／mL EB。

CO2培養(yǎng)箱 Heal Force Development公司產(chǎn)品，型號(hào)：BB5060UV；紫外分光光度計(jì)，Cambridge公司產(chǎn)品，型號(hào)：78062；熒光分光光度計(jì)，日本島津Shimazu公司產(chǎn)品，型號(hào)：RF－540。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取生長(zhǎng)良好的CHL，以5×108個(gè)／L的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，經(jīng)24h培養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（生理鹽水，不加SiO2）；SiO2（100μg／mL）組；ZnG（2.25 μg／mL）組；MnCl2（1.5μg／mL）組；SiO2＋ZnG組（培養(yǎng)液除含100μg／mL SiO2外，分別含 ZnG 1.00、1.50、2.25μg／mL）；SiO2＋MnCl2組（除含100μg／mL SiO2外，分別含 MnCl20.25、0.50、1.00μg／mL）；ZnG和 MnCl2聯(lián)合作用組（每組除含SiO2100mg／L外，采用析因設(shè)計(jì)，ZnG＋MnCl2共設(shè)9個(gè)濃度組，染毒2h）。

1.2.2 酚提法提取細(xì)胞DNA 加入細(xì)胞消化液600μL，56℃水浴過(guò)夜，用等體積飽和酚－氯仿異戊醇溶液反復(fù)抽提，取上清液，加入100%冰乙醇沉淀DNA，并用70%乙醇洗2次，室溫晾干，干燥的DNA用適量雙蒸水溶解，待用。

1.2.3 DNA 交聯(lián)的測(cè)定［6－8］采用EB熒光法。DNA交聯(lián)率的計(jì)算按下述公式：

ct%＝（變性DNA熒光－空白熒光）／（未變性DNA熒光－空白熒光）×100%。式中空白熒光為EB緩沖液的熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析和析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZnG拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對(duì)照組比，P＜0.05），2.25μg／mL的ZnG對(duì)未染塵的 CHL DNA交聯(lián)作用與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化（P＞0.05）。在染塵CHL中加入不同濃度的ZnG（1.00、1.50、2.25μg／mL）后，DNA交聯(lián)率明顯下降（與SiO2組比較，P＜0.05），隨著ZnG的濃度增加，DNA交聯(lián)率越低，見(jiàn)表1。

表1 ZnG拮抗SiO2對(duì)CHL DNA的交聯(lián)作用（±s，n＝6）

表1 ZnG拮抗SiO2對(duì)CHL DNA的交聯(lián)作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對(duì)照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊ZnG（2.25μg／mL）組 4.61±0.89＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）組 14.77±0.75＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）組 12.18±0.68＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）組 9.12±0.61＊＃

2.2 MnCl2拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對(duì)照組比，P＜0.05），1.00μg／mL的 MnCl2對(duì)未染塵的CHL DNA交聯(lián)作用與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在染塵CHL中加入不同濃度的 MnCl2（0.25、0.50、1.00μg／mL）后，DNA交聯(lián)率明顯下降（與SiO2組比較，P＜0.05），隨著MnCl2的濃度增加，DNA交聯(lián)率越低，見(jiàn)表2。

表2 MnCl2拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用±s，n＝6）

表2 MnCl2拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與生理鹽水對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2 組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對(duì)照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊MnCl2（1.00μg／mL）組 4.71±0.84＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 15.17±0.72＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 11.88±1.02＊＃SiO2（100μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 9.00±0.83＊＃

表3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用（±s，n＝6）

表3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用（±s，n＝6）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與SiO2 組比較。

組別DNA交聯(lián)率（%）對(duì)照組 4.72±0.85＃SiO2（100μg／mL）組 17.73±0.94＊SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 13.24±0.82＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 13.16±1.42＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.00μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 13.01±1.48＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 12.87±0.47＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 8.32±0.85＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（1.50μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 12.52±0.28＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.25μg／mL）組 12.51±1.35＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（0.5μg／mL）組 12.15±1.08＊＃SiO2（100μg／mL）＋ZnG（2.25μg／mL）＋MnCl2（1.0μg／mL）組 11.87±0.95＊＃

表4 ZnG與MnCl2聯(lián)合對(duì)DNA交聯(lián)作用影響的方差分析

2.3 ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用 100μg／mL的SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高（與對(duì)照組比，P＜0.05），析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，ZnG和MnCl2的交互作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、4。在染塵CHL中加入1.50μg／mL的ZnG與0.50μg／mL的MnCl2時(shí)，拮抗SiO2對(duì)CHL DNA交聯(lián)的聯(lián)合作用效果最好。

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SiO2可引起CHL DNA交聯(lián)率明顯升高，在染塵CHL中加入不同濃度的ZnG、MnCl2后，DNA交聯(lián)率明顯下降。

鋅、錳對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用機(jī)制涉及多方面［9－11］：錳與DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成關(guān)系密切，是其合成過(guò)程中多種酶的組成成分和激活劑；可與DNA帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生穩(wěn)定作用而維持DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，防止結(jié)構(gòu)的突變；還可構(gòu)成Mn－SOD，可抵抗自由基對(duì)DNA的攻擊。鋅是核酸的豐富組分，能穩(wěn)定RNA、DNA、和核糖體的結(jié)構(gòu)，鋅可通過(guò)鍵合于DNA骨架鏈上的磷酸基團(tuán)和核苷的堿基而穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)采用析因設(shè)計(jì)研究ZnG與MnCl2聯(lián)合應(yīng)用拮抗SiO2對(duì)CHL的DNA交聯(lián)作用，方差分析結(jié)果表明，ZnG與MnCl2的交互作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在染塵CHL中加入1.50μg／mL的ZnG與0.50μg／mL的 MnCl2聯(lián)合作用時(shí)，拮抗SiO2對(duì)CHL DNA交聯(lián)的效果最好。二者聯(lián)合拮抗SiO2致細(xì)胞DNA損傷的作用機(jī)制可能是它們共同抗氧化的結(jié)果。

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