莫 索，賀元欣，劉 歡，王 彥，魏 剛，張 琦，王會(huì)巖 (吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性是當(dāng)今全球性難題，因此，發(fā)展新的動(dòng)物抗感染戰(zhàn)略勢(shì)在必行。防御素(defensin)作為一種新型的生物活性肽，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)理，不受傳統(tǒng)抗生素耐藥菌株影響，它可以替代抗生素而發(fā)揮更廣譜的抗菌作用，同時(shí)它也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，在感染中發(fā)揮重要作用［1］。據(jù)報(bào)道，雞體內(nèi)的基因共編碼了13種雞β-防御素(chicken defensinβ，Gal)，這些雞防御素基因被命名為Gallinacin 1-13［2］。由于機(jī)體自身合成法操作復(fù)雜，不易提取分離純化，而且獲得量少，因此現(xiàn)在多采用基因工程合成法，此法易于大規(guī)模生產(chǎn)防御素，并且基因克隆與表達(dá)為其大規(guī)模生產(chǎn)提供了手段［3］。

雖然非代謝性乳糖類似物IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)是一種廣泛使用的高效乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，它通過調(diào)節(jié)Lac啟動(dòng)子，使目的基因片段得以轉(zhuǎn)錄獲得所需目的蛋白［4］。目前IPTG通常用于外源蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)中，但價(jià)格昂貴且對(duì)人體存在潛在的毒性，世界上一些國(guó)家已明文規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)［5］，因此尋求IPTG的替代物已成為國(guó)內(nèi)外規(guī)模化生產(chǎn)基因工程重組藥物的迫切需求。乳糖是乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物，與IPTG不同的是它必須借助乳糖通透酶作用進(jìn)入細(xì)胞，并經(jīng)β-半乳糖苷酶作用轉(zhuǎn)化為異乳糖后方能起誘導(dǎo)作用［6-7］。同時(shí)乳糖本身作為一種碳源，不斷被細(xì)菌代謝利用。因此乳糖作為誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)過程，其誘導(dǎo)劑濃度始終處于動(dòng)態(tài)變化過程中，誘導(dǎo)過程更加復(fù)雜，需對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行更細(xì)致的研究和優(yōu)化［8-10］。本研究在成功構(gòu)建Gal-3工程菌的基礎(chǔ)上，用乳糖作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行高效表達(dá)研究，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

含pET20b-SUMO-Gal-3重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)由王會(huì)巖博士構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨(Tryptone)和酵母粉(Yeast Extract)為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品;IPTG為德國(guó)Merck產(chǎn)品;氨芐青霉素(Amp)和Marker為Takaka產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS為Sigma產(chǎn)品;乳糖及其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?JY92-2D超聲破碎儀為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 乳糖誘導(dǎo)工藝優(yōu)化

從超低溫冰箱取出一支甘油菌，按1∶200的比例接種到LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，按1∶100接種量將活化菌種接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基(含100 mg/L Amp)的150 mL三角瓶中，37℃、180 r/min培養(yǎng)，并在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)菌體A600達(dá)到0.6～0.8時(shí)分別添加20%乳糖至終濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 和 10.0 g/L，37 ℃ 誘導(dǎo)時(shí)間3 h，確定最佳誘導(dǎo)濃度;在菌體生長(zhǎng)至A600為0.6～0.8時(shí)加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)0～6 h，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間;在菌體生長(zhǎng)的不同時(shí)期A600為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2時(shí)加入相同量的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃誘導(dǎo)時(shí)間3 h，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī);選擇不同的溫度(25℃、30℃、33℃、37℃)進(jìn)行誘導(dǎo)，確定最佳誘導(dǎo)溫度;根據(jù)上述確定的條件，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)時(shí)，一次加入乳糖至最佳濃度，同時(shí)分兩次(間隔1.5 h)添加乳糖至終濃度作對(duì)照，確定乳糖添加方式對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。

1.4 重組蛋白可溶性分析

收集菌液，8 000 r/min離心10 min。菌體按1∶8比例(kg/L)用Tris-HCl pH 9.2粗提工作液重懸，吹打均勻后，于冰浴下超聲破碎，每次8 min，共計(jì)6次。破碎后以12 000 r/min離心15 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，測(cè)定目標(biāo)蛋白在上清和沉淀中的含量。

2 結(jié)果

2.1 最適誘導(dǎo)濃度確定

搖瓶實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的乳糖對(duì)外源蛋白的表達(dá)均有一定作用。隨乳糖濃度的增加產(chǎn)物表達(dá)量隨之增加，在2.0 g/L達(dá)到最大值，然后隨乳糖濃度的增加表達(dá)量趨于減少，乳糖濃度過高則對(duì)菌體的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，產(chǎn)物表達(dá)量也降低，并用IPTG誘導(dǎo)的最佳條件作對(duì)照。經(jīng)凝膠成像分析得出:最佳乳糖誘導(dǎo)濃度為2.0 g/L。見圖1。

2.2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

菌液37℃培養(yǎng)至A600為0.6～0.8后加入最佳誘導(dǎo)濃度乳糖，進(jìn)行最佳誘導(dǎo)時(shí)間的測(cè)定。每間隔1 h取1 mL菌液，并進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳。誘導(dǎo)3 h后表達(dá)量及產(chǎn)物量最高。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)物的表達(dá)量會(huì)逐漸降低。見圖2。

圖1 最佳誘導(dǎo)濃度的確定

圖2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

2.3 最適誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

將活化的種子接種于LB培養(yǎng)基中，并在A600為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 時(shí)加入2.0 g/L 乳糖誘導(dǎo)3 h。在菌體生長(zhǎng)的各個(gè)階段加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)均能表達(dá)出外源蛋白，且菌體密度變化不大，表明乳糖對(duì)菌體生長(zhǎng)無抑制作用。經(jīng)凝膠成像分析得出:在A600為0.8時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)量達(dá)到最大值。見圖3。

2.4 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

選擇不同誘導(dǎo)溫度(25℃、30℃、33℃和37℃)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)結(jié)束后取1 mL菌液，并進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳。經(jīng)凝膠成像分析得出:溫度升高有利于蛋白的表達(dá)，隨溫度升高蛋白表達(dá)量增大，37℃蛋白表達(dá)量最高。見圖4。

圖3 最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

圖4 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

2.5 分批添加乳糖對(duì)蛋白表達(dá)量的影響

菌體培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時(shí)，加入乳糖。一次加入乳糖至最佳濃度，另一組分兩次(間隔1.5h)加入乳糖至最佳濃度。進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳。經(jīng)凝膠成像分析得出:添加乳糖的表達(dá)量略高，乳糖本身可以作為碳源被菌體所利用，分批添加有利于蛋白的表達(dá)。見圖5。

2.6 重組蛋白可溶性分析

收集菌液，8 000 r/min離心10 min。菌體按1∶8比例(kg/L)用Tris-HCl pH 9.2粗提工作液重懸，吹打均勻后，于冰浴下超聲破碎，每次8 min，共計(jì)6次。破碎后以12 000 r/min離心15 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，測(cè)定目標(biāo)蛋白在上清和沉淀中的含量，目標(biāo)蛋白絕大多數(shù)分布于上清中，以可溶性表達(dá)為主。

圖5 乳糖添加方式的影響

圖6 乳糖誘導(dǎo)外源蛋白的可溶性分析

3 討論

乳糖操縱子是目前研究得最為詳盡的基因操縱子。乳糖是乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)物，與IPTG誘導(dǎo)機(jī)理有明顯差別:IPTG可以直接進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部而發(fā)揮誘導(dǎo)作用，且它是一種非代謝性誘導(dǎo)物，不會(huì)被菌體利用。因此乳糖的誘導(dǎo)過程及其對(duì)菌體的影響比IPTG復(fù)雜得多，誘導(dǎo)效率也不如IPTG，但乳糖所具備的無毒和價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，使得其在重組蛋白的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中仍具有優(yōu)于IPTG的潛在價(jià)值和優(yōu)勢(shì)［11］。

本實(shí)驗(yàn)深入研究了以乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)，影響菌株生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物表達(dá)的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間和添加方式等因素，從中分析并尋找適合工程菌株生長(zhǎng)和誘導(dǎo)的條件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在工程菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)初期加入終濃度為2.0 g/L的乳糖37℃誘導(dǎo)3 h獲得蛋白表達(dá)量最大，分批添加乳糖效果稍好一點(diǎn)，與IPTG相比較，兩者表達(dá)量相當(dāng)。從蛋白可溶性分析可知:由于IPTG是非常高效的誘導(dǎo)劑，加入后外源蛋白迅速表達(dá)易形成包涵體，為后期的純化帶來不便;而乳糖為溫和的誘導(dǎo)物，其誘導(dǎo)作用相對(duì)緩慢，因此外源蛋白有充足時(shí)間進(jìn)行正確折疊，盡可能形成正確構(gòu)象，在表達(dá)動(dòng)力學(xué)上有利于蛋白的可溶性表達(dá)，易以可溶性蛋白存在于細(xì)胞內(nèi)［12］，蛋白基本都存在于上清中。本研究結(jié)果證明了乳糖可以作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，初步證明其可行性。為以乳糖為誘導(dǎo)劑生產(chǎn)基因重組工程藥物提供了一定的可行性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有益的參考和借鑒。

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