韋思明，顏志中，周 劍

(1. 浙江醫(yī)學高等?？茖W校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

·基礎與臨床研究·

樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療腎細胞癌的實驗研究

韋思明1，顏志中2，周 劍3

(1. 浙江醫(yī)學高等?？茖W校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市紅十字會醫(yī)院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

目的：探討抗CD137抗體是否能加強樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤效應。方法將Renca腎癌細胞注入Balb/c小鼠皮下。3天后，小鼠被隨機分為4組，分別給予未治療、樹突狀細胞疫苗治療、抗CD137抗體治療、樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療。腫瘤種植后20天，小鼠被處死，獲取脾臟分析T細胞活性。通過測量腫瘤大小來評定抗腫瘤效應。結果相比于未治療，各種治療顯著增加了T細胞活性，抑制了腫瘤生長，尤以聯(lián)合治療的作用為最強。結論聯(lián)合治療通過增加T細胞活性來提高抗腫瘤效應。

樹突狀細胞疫苗;CD137;腎細胞癌

Abstract: [Objective] To investigate whether anti-CD137 antibody can potentiate antitumor effect of dendritic cell (DC) vaccine. [Method] A renal cell carcinoma model was established by subcutaneous injection of Renca tumor cells into Balb/c mice. After 3 days, tumor-bearing mice were not treated or treated with DC vaccine, anti-CD137 antibody, or both combinations. Mice were killed on day 20 after tumor cell inoculation, and spleens were harvested for analysis of T cell activity. The antitumor effect was assessed by measuring tumor size. [Result] Compared with un-treatment, different treatments significantly increased T-cell activity, and inhibited tumor growth, with the highest effect in combination therapy. [Conclusion] Combination therapy can enhance antitumor effect by increasing T-cell activity.

Keywords: DC vaccine; CD137; renal cell carcinoma

樹突狀細胞是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞。利用樹突狀細胞制成的疫苗已被應用于臨床治療腎細胞癌[1]。它通過激活腫瘤特異性T淋巴細胞來誘導抗腫瘤免疫反應。然而，臨床緩解率僅為37%[1]。因此，如何加強樹突狀細胞疫苗的治療效果是急需解決的重要課題。CD137(又稱4-1BB)是一個協(xié)同刺激分子，主要表達在激活的T細胞上[2]?？笴D137抗體與CD137的結合可以刺激T細胞活化[3]。在本研究中，我們探討了樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療腎細胞癌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡的Balb/c小鼠購于上海實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2007-0005。腎癌細胞株Renca來源于美國細胞、菌種庫。重組鼠的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素4、腫瘤壞死因子α、干擾素γ購于R&D Systems公司。異硫氰酸熒光素標記的抗CD11c、CD3單抗，以及藻紅蛋白標記的抗CD83、CD137單抗均購自BD PharMingen公司。T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞分離試劑盒系Miltenyi Biotec公司生產(chǎn)。抗鼠CD137單克隆抗體購于R&D Systems公司。鉻酸鈉來自PerkinElmer公司。檢測干擾素γ的試劑盒購自BD PharMingen公司。

1.2 樹突狀細胞疫苗的制作

取Balb/c小鼠的股骨，洗出骨髓細胞。骨髓細胞與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(10 ng/ml)、白細胞介素4(10 ng/ml)等一起培養(yǎng)。第二天棄懸浮細胞，隔日半量換液并加入新鮮細胞因子，第7天收獲未成熟樹突狀細胞。Renca腎癌細胞反復凍融后得到細胞溶解產(chǎn)物(即腫瘤抗原)。未成熟樹突狀細胞與腫瘤抗原以1:3比例混合培養(yǎng)，并加入腫瘤壞死因子α(10 ng/ml)、干擾素γ(10 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)16小時，誘導樹突狀細胞成熟。負載腫瘤抗原的樹突狀細胞就是成熟樹突狀細胞，也就是樹突狀細胞疫苗。通過細胞表型分析來證實培養(yǎng)的細胞為樹突狀細胞。

1.3 樹突狀細胞表型分析

收獲未成熟和成熟樹突狀細胞，用異硫氰酸熒光素標記的抗CD11c (樹突狀細胞標志)單抗、藻紅蛋白標記的抗CD83(樹突狀細胞成熟標志)單抗染色，流式細胞儀分析細胞表面CD11c和CD83的表達。

1.4 T細胞表面CD137表達的分析

將Balb/c小鼠的脾臟制成細胞懸液，用T細胞分離試劑盒從脾細胞中分離出T細胞。純化的T細胞(1×105/孔)單獨培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，或者與樹突狀細胞疫苗(1×104/孔)共同培養(yǎng)。3天后，收獲T細胞，用異硫氰酸熒光素標記的抗CD3(T細胞標志)單抗、藻紅蛋白標記的抗CD137單抗染色，流式細胞儀分析CD137在T細胞上的表達。

1.5 小鼠腎腫瘤模型的制作及腫瘤治療

取Balb/c小鼠40只，將5×105的Renca腎癌細胞接種于每只小鼠的右腹皮下。3天后，小鼠隨機分成4組，每組10只。對照組：未經(jīng)任何治療。樹突狀細胞疫苗治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將1×106的樹突狀細胞疫苗注入小鼠左腹皮下?？笴D137抗體治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將100 μg抗CD137抗體注入小鼠腹腔內(nèi)。聯(lián)合治療組：在腫瘤接種后第3天與第10天，將1×106的樹突狀細胞疫苗注入小鼠左腹皮下，在第6天與第13天，將100 μg抗CD137抗體注入小鼠腹腔內(nèi)。腫瘤種植后20天，處死小鼠，用卡尺測量腫瘤的長徑與橫徑，它們相乘的結果記錄為腫瘤大小。

1.6 鉻標記釋放法檢測細胞毒作用

以Renca腎癌細胞作為靶細胞，與鉻酸鈉混合培養(yǎng)1小時，以便靶細胞被標記上鉻。腫瘤種植后20天，取對照組和不同治療組小鼠的脾臟。用CD8+T細胞分離試劑盒從脾細胞中分離出CD8+T細胞。CD8+T細胞與樹突狀細胞疫苗以10:1的比例混合培養(yǎng)。5天后，致敏的CD8+T細胞作為效應細胞與鉻標記的靶細胞混合培養(yǎng)，比例為100:1。4小時后取上清液，用γ計數(shù)儀測定鉻釋出量。通過公式：靶細胞溶解百分率=[(實驗組鉻釋出量—自發(fā)鉻釋出量)/(最大鉻釋出量—自發(fā)鉻釋出量)]×100來評估CD8+T細胞殺傷腫瘤細胞的活性。

1.7 干擾素γ水平的檢測

腫瘤種植后20天，取對照組和不同治療組小鼠的脾臟。用CD4+T細胞分離試劑盒從小鼠脾細胞中分離出CD4+T細胞。將CD4+T細胞和樹突狀細胞疫苗以10:1的比例混合培養(yǎng)，24小時后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測上清液中干擾素γ的水平。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 軟件處理數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樹突狀細胞特征

未成熟樹突狀細胞CD11c和CD83的表達率分別為85.9%(即3.6%+82.3%)和3.6%；成熟樹突狀細胞(也就是樹突狀細胞疫苗)CD11c和CD83的表達率分別為87.1%(即71.5%+15.6%)和71.5%，見圖1。由此可見，未成熟和成熟樹突狀細胞均高表達CD11c(樹突狀細胞標志)，表明培養(yǎng)的細胞是樹突狀細胞。成熟樹突狀細胞CD83(樹突狀細胞成熟標志)表達率明顯高于未成熟樹突狀細胞。

圖1 流式細胞儀分析樹突狀細胞表面標志CD11c、CD83的表達

2.2 T細胞上CD137的表達

未受刺激的T細胞CD137表達率為0.9%；受樹突狀細胞疫苗刺激后，T細胞上CD137的表達率明顯增加，為35.2%，見圖2。

圖2 流式細胞儀分析T細胞上CD137的表達

2.3 各種治療方法對小鼠腎腫瘤生長的影響

表1顯示：與對照組相比，樹突狀細胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的腫瘤明顯縮小(t=13.15,P<0.0001;t=6.89,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的腫瘤明顯小于對照組、樹突狀細胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t= 25.30,P< 0.0001;t= 10.58,P<0.0001;t=16.27,P< 0.0001)。

表1 各種治療方法對腫瘤大小、殺傷率及干擾素γ水平的影響

注：▲：與對照組比較P<0.0001;◆：與其他3組比較P< 0.0001

2.4 細胞毒實驗

表1顯示：與對照組相比，樹突狀細胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的CD8+T細胞對腎癌細胞殺傷率明顯增加(t=15.24,P<0.0001;t=8.55,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的殺傷率明顯高于對照組、樹突狀細胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t=19.16,P<0.0001;t=6.84,P<0.0001;t=11.37,P<0.0001)。

2.5 各種治療方法對干擾素γ水平的影響

表1顯示：與對照組相比，樹突狀細胞疫苗治療組和抗CD137抗體治療組的干擾素γ水平明顯提高(t=23.47,P<0.0001;t=17.93,P<0.0001)。聯(lián)合治療組的干擾素γ水平明顯高于對照組、樹突狀細胞疫苗治療組及抗CD137抗體治療組(t=24.95,P<0.0001;t=7.91,P<0.0001;t=13.54,P<0.0001)。

3 討論

腎細胞癌位居泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位(僅次于膀胱癌)。治療局限性腎癌的方法是行手術切除術，但這些患者中40%仍會復發(fā)、轉(zhuǎn)移[4]。此外，30%患者在首次發(fā)現(xiàn)腎癌時已有遠處轉(zhuǎn)移，此時外科手術已無能為力[5]。腎癌對化療和放療不敏感。因此，這類患者預后極差，平均生存時間只有9個月[1]。腎癌是一種免疫原性腫瘤，故免疫治療是目前治療腎癌的有效措施[6]。

腫瘤免疫過程中，抗原遞呈細胞處于中心環(huán)節(jié)。樹突狀細胞是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞，它捕獲加工處理腫瘤抗原并遞呈腫瘤抗原給CD4+、CD8+?T細胞，刺激T細胞活化[7]。其中CD8+?T細胞活化后可以直接識別殺死腫瘤細胞，而CD4+?T細胞活化后，通過分泌干擾素、白細胞介素2等細胞因子來激活CD8+?T細胞，促進CD8+?T細胞殺傷腫瘤細胞。使用樹突狀細胞疫苗治療腎癌病人已成為近幾年的熱點。在國外14次臨床試驗中，197名腎癌轉(zhuǎn)移患者接受了樹突狀細胞疫苗治療，73人治療有效，占37%(73/197)[1]。其中4人腫瘤完全消失；8人腫瘤體積縮小50%以上，且沒有出現(xiàn)新的病灶；61人腫瘤體積縮小50%以下。整個治療過程中僅出現(xiàn)輕微的副作用，如：低熱，疲勞，腹瀉，感冒癥狀。以上臨床試驗顯示：樹突狀細胞疫苗治療腎癌是安全有效的，但它的臨床療效只有37%。如何提高疫苗的療效是一個研究重點。

CD137是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，它被表達在激活的CD4+和CD8+?T細胞上[2]。已有研究報道：抗CD137抗體與T細胞上CD137的結合可以刺激T細胞活化[3]。因此，我們的設想是：用樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體治療小鼠腎細胞癌，提高抗腎腫瘤功效。首先將樹突狀細胞疫苗注入小鼠體內(nèi)，樹突狀細胞疫苗遞呈腫瘤抗原給T細胞，刺激T細胞活化、表達CD137，隨后將抗CD137抗體注入小鼠體內(nèi)，抗CD137抗體與T細胞上的CD137結合，促進 T細胞進一步活化，增加抗腎腫瘤功效。到目前為止，國內(nèi)外均未見同類研究報道。我們的研究顯示：T細胞受到樹突狀細胞疫苗刺激后上調(diào)了CD137的表達，這為抗CD137抗體的隨后應用提供了科學依據(jù)。我們還發(fā)現(xiàn)：相比于樹突狀細胞疫苗或抗CD137抗體的單一治療，樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體顯著抑制了腫瘤生長，這意味著聯(lián)合治療的協(xié)同抗癌效應。此外，在聯(lián)合治療過程中我們沒有發(fā)現(xiàn)小鼠死亡及靈活性的改變，說明聯(lián)合治療沒有明顯的毒性。

通過細胞毒性試驗和細胞因子分泌試驗可以檢測抗腫瘤免疫反應。相比于單一治療，接受聯(lián)合治療的小鼠有更高的細胞毒性，這表明聯(lián)合治療增加了CD8+?T細胞殺傷腫瘤細胞的活性。在細胞因子分泌試驗中，聯(lián)合治療的小鼠顯示了更高的干擾素γ水平，這提示聯(lián)合治療提高了CD4+?T細胞分泌干擾素γ的活性，而干擾素γ能激活CD8+?T細胞的殺傷活性。綜合所有的結果，我們認為聯(lián)合治療通過增加T細胞活性來提高抗腫瘤效應。

總之，我們的發(fā)現(xiàn)首次證實：樹突狀細胞疫苗聯(lián)合抗CD137抗體能提高抗腎癌的效應。這為臨床上治療腎癌提供了一條新的思路，具有廣泛的應用前景。

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Experimentalstudyofrenalcellcarcinomatreatedwithcombinationofdendriticcellvaccinewithanti-CD137antibody

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3
(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China； 2. Red Cross Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

R737.11

A

1672-0024(2012)04-0047-04

韋思明(1971- ),男,浙江杭州人，博士，副教授,副研究員。研究方向：泌尿外科學

浙江省錢江人才計劃基金資助項目(文件號:浙人社發(fā)[2009]194號)；浙江省教育廳科學基金資助項目(編號:Y200805942)