楊 靜 于巖波 于 卉 左秀麗 陳哲宇 李延青#

山東省千佛山醫(yī)院消化內(nèi)科1（250014） 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院消化內(nèi)科2 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所3

腹部不適和疼痛是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD）和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）患者的臨床常見(jiàn)癥狀。目前認(rèn)為內(nèi)臟高敏感是IBD和IBS患者相關(guān)疼痛癥狀的主要病理生理機(jī)制，表現(xiàn)為對(duì)直腸擴(kuò)張刺激的感覺(jué)閾值降低和（或）對(duì)刺激的反應(yīng)強(qiáng)度增加[1]。IBD和IBS患者常伴有尿頻、尿急、排尿痛等膀胱高敏感并發(fā)癥，這些并發(fā)癥加重了對(duì)患者生活質(zhì)量的負(fù)面影響，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚。內(nèi)臟感覺(jué)通過(guò)胞體位于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia,DRG）的脊髓內(nèi)臟傳入纖維傳遞至次級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，進(jìn)而投射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。DRG內(nèi)關(guān)鍵分子的調(diào)控作用以及表達(dá)已成為近年內(nèi)臟敏感性機(jī)制研究的熱點(diǎn)。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)家族成員，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)BDNF參與調(diào)控痛覺(jué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，然而系統(tǒng)應(yīng)用BDNF基因敲除（BDNF+/-）小鼠研究BDNF在內(nèi)臟敏感性中的調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)建立BDNF+/-小鼠結(jié)腸炎后內(nèi)臟高敏感模型，旨在探討B(tài)DNF是否參與小鼠內(nèi)臟敏感性的調(diào)節(jié)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

雜合子BDNF+/-C57BL/6小鼠38只和同窩正常野生型（BDNF+/+）C57BL/6小鼠38只由山東大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。從鼠尾組織標(biāo)本中提取DNA通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）行基因分型。小鼠于（21±1）℃溫度、50%±5%空氣濕度、避強(qiáng)光的環(huán)境中喂養(yǎng)，自由飲水、攝食。

TNBS、苯巴比妥鈉（Sigma 公司），ELISA BDNF試劑盒（Promega公司）。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），乙醇、多聚甲醛等購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

二、動(dòng)物分組和模型建立

所有小鼠分為BDNF+/+對(duì)照組、BDNF+/+TNBS炎癥組、BDNF+/-對(duì)照組和BDNF+/-TNBS炎癥組，每組各19只。按照Engel等[4]的方法制備結(jié)腸炎后內(nèi)臟高敏感小鼠模型。1.75 mg TNBS溶解于50%的乙醇中，終體積為0.1 mL。以注射器吸取配置好的TNBS，然后與一內(nèi)徑為1.2 mm的聚乙烯塑料管相連，導(dǎo)管末端用石蠟油充分潤(rùn)滑以避免操作對(duì)結(jié)腸黏膜的物理性損傷。小鼠灌腸前24 h禁食不禁水，乙醚吸入麻醉后，將導(dǎo)管緩慢插入降結(jié)腸直至導(dǎo)管末端距小鼠肛門約4 cm處，將TNBS緩緩?fù)迫虢到Y(jié)腸。為避免TNBS外漏，保持小鼠倒立約30 s。對(duì)照組給予同等劑量的50%乙醇。

三、結(jié)腸和膀胱組織學(xué)檢查

造模7 d后，每組隨機(jī)取7只小鼠腹腔注射過(guò)量苯巴比妥鈉（200 mg/kg）處死，取遠(yuǎn)端3 cm的降結(jié)腸和膀胱，于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm，行HE染色。由對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作全盲的病理醫(yī)師行結(jié)腸組織學(xué)半定量評(píng)分[5]：0 分，正常無(wú)炎癥；1 分，低度炎癥；2 分，中等炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3分，高度炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，高度血管密度，腸壁增厚；4分，透壁炎癥，杯狀細(xì)胞缺失，高度血管密度，腸壁增厚。膀胱組織病理學(xué)半定量評(píng)分[6]：0分，正常無(wú)炎癥；1分，低度炎癥，無(wú)或低度水腫；2分，中度炎性浸潤(rùn)和水腫；3分，重度炎性浸潤(rùn)和水腫。

四、ELISA測(cè)定DRG內(nèi)BDNF表達(dá)

上述行組織學(xué)檢查的小鼠同時(shí)快速取支配結(jié)腸的脊髓胸腰部 T10-L1（TL）和腰骶部 L6-S1（LS）DRG，加入蛋白裂解緩沖液裂解30 min，行BCA蛋白定量。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)。

五、內(nèi)臟敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠行結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal distension,CRD）并記錄腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex,AWR）評(píng)分[7]。 乙醚輕度麻醉小鼠后，將緊密連接于聚四氟乙烯導(dǎo)管上特制的 2 cm聚乙烯塑料球囊輕輕插入降結(jié)腸，球囊近端距肛門約0.5 cm，導(dǎo)管用膠布固定于鼠尾。導(dǎo)管另一端緊密連接水銀血壓計(jì)。待小鼠充分蘇醒并適應(yīng)后，分別在 0、15、30、45、60 和 80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力下行結(jié)腸球囊擴(kuò)張。每次擴(kuò)張持續(xù)20 s，間隔4 min。由對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)全盲的觀察者記錄不同壓力下AWR評(píng)分，所有測(cè)量均重復(fù)3次。AWR評(píng)分系統(tǒng)：0分：對(duì)球囊擴(kuò)張無(wú)反應(yīng)；1分：身體靜止不動(dòng)或頭部運(yùn)動(dòng)減少；2分：腹部肌肉收縮；3分：腹部抬高；4分：骨盆抬起，身體呈弓形。

六、膀胱敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠以1.2 g/kg氨基甲酸酯腹腔注射麻醉，中下腹部逐層剖開(kāi)，暴露出膀胱，在膀胱頂部制一小切口，緩緩插入PE50導(dǎo)管，以氨基丙烯酸酯黏膠固定，15 min后膀胱排空。導(dǎo)管另一端通過(guò)三通管連接至灌流泵和壓力換能器上。2 min后，0.9%NaCl溶液以20 μL/min的速度持續(xù)灌流2 h，建立穩(wěn)定而可重復(fù)排尿的膀胱內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)。記錄三次排尿間隔時(shí)間[8]，取均值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸和膀胱組織學(xué)檢查

對(duì)于兩種不同基因型的小鼠，TNBS均可誘導(dǎo)明顯的結(jié)腸炎癥，組織學(xué)檢查表現(xiàn)為節(jié)段性潰瘍形成，腸黏膜中度充血水腫，大量炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和部分上皮壞死脫落（見(jiàn)圖1）。BDNF+/+TNBS炎癥組結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分顯著高于BDNF+/+對(duì)照組（P<0.01），BDNF+/-TNBS炎癥組評(píng)分亦顯著高于BDNF+/-對(duì)照組（P<0.01），而兩個(gè)炎癥組之間相比無(wú)明顯差異（見(jiàn)表 1）。

各組小鼠膀胱組織學(xué)切片均顯示結(jié)構(gòu)正常完整，無(wú)炎癥指征（見(jiàn)圖2），組織學(xué)評(píng)分均為0。

二、DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)

非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠支配結(jié)腸的TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)均約為BDNF+/+小鼠的一半，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩種不同基因型的TNBS炎癥組TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)均顯著高于相應(yīng)對(duì)照組（P<0.01）。BDNF+/-TNBS炎癥組TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)顯著低于 BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.001）（見(jiàn)表 1）。

三、不同擴(kuò)張壓力下小鼠AWR評(píng)分

非炎癥狀態(tài)下，擴(kuò)張壓力<60 mm Hg時(shí)，BDNF+/-小鼠AWR評(píng)分與BDNF+/+小鼠相比無(wú)明顯差異；而擴(kuò)張壓力為60、80 mm Hg時(shí)，BDNF+/+小鼠AWR評(píng)分顯著高于BDNF+/-小鼠（P<0.05）。在BDNF+/+小鼠中，擴(kuò)張壓力≥30 mm Hg時(shí)，TNBS炎癥組AWR評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；擴(kuò)張壓力<30 mm Hg時(shí)兩組無(wú)明顯差異。在BDNF+/-小鼠中，擴(kuò)張壓力≥45 mm Hg時(shí)，TNBS炎癥組AWR評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；擴(kuò)張壓力<45 mm Hg時(shí)兩組無(wú)明顯差異。擴(kuò)張壓力≥30 mm Hg時(shí)，BDNF+/-TNBS炎癥組AWR評(píng)分顯著低于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.05）（見(jiàn)表 1、圖 3）。

表1 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分、BDNF蛋白表達(dá)、AWR評(píng)分和排尿間隔比較（）

表1 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分、BDNF蛋白表達(dá)、AWR評(píng)分和排尿間隔比較（）

與同基因型對(duì)照組比較，*P<0.01，**P<0.001；與 BDNF+/+TNBS 炎癥組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；△與 BDNF+/+對(duì)照組比較，P<0.05

四、膀胱敏感性

非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠與BDNF+/+小鼠的排尿間隔相比無(wú)明顯差異。兩種不同基因型TNBS炎癥組排尿間隔均顯著短于相應(yīng)對(duì)照組（P<0.001）。BDNF+/-TNBS炎癥組排尿間隔顯著高于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.01）（見(jiàn)表 1）。

討 論

根據(jù)解剖學(xué)分布特點(diǎn)，支配結(jié)腸DRG的神經(jīng)元纖維主要分為兩類：一類為內(nèi)臟神經(jīng)，神經(jīng)元胞體位于脊髓胸腰段T10-L1；另一類為盆神經(jīng)，胞體位于脊髓腰骶段L6-S1[9]。這些神經(jīng)纖維裸露的末梢分布于腸壁各層，分別沿著交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)走行，穿過(guò)椎旁節(jié)和椎前節(jié)，到達(dá)脊髓后角。內(nèi)臟敏感性的變化主要由外周和中樞機(jī)制引起[2]。各種原因引起的感覺(jué)神經(jīng)末梢和初級(jí)傳入神經(jīng)元的致敏均可誘導(dǎo)中樞敏感化，探索DRG內(nèi)參與結(jié)腸炎后致敏的關(guān)鍵分子對(duì)明確結(jié)腸高敏感的發(fā)生機(jī)制有重要意義。

BDNF廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，可維持胚胎期神經(jīng)元的存活、分化，并參與調(diào)節(jié)成熟神經(jīng)元的功能。既往研究認(rèn)為，BDNF可調(diào)控突觸可塑性，并參與學(xué)習(xí)、記憶等多項(xiàng)功能[10]。有研究發(fā)現(xiàn)BDNF亦參與痛覺(jué)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控[3]。在外周炎癥誘導(dǎo)的疼痛模型中，DRG內(nèi)BDNF表達(dá)明顯上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射BDNF抗體能抑制后足切割疼痛模型的痛覺(jué)過(guò)敏，表明BDNF參與神經(jīng)源性軀體疼痛[11]。臨床研究[12]亦發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎患者的胰腺組織內(nèi)BDNF表達(dá)明顯上調(diào)，并與胰腺炎性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中，非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)明顯低于BDNF+/+小鼠，但兩種基因型小鼠間結(jié)腸敏感性無(wú)明顯差異。僅球囊擴(kuò)張壓力≥60 mm Hg時(shí)，相較于BDNF+/+小鼠，BDNF+/-小鼠表現(xiàn)為結(jié)腸低反應(yīng)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于BDNF+/-和BDNF+/+小鼠，TNBS均有顯著的炎性致敏作用。TNBS模型是研究腸道傳入神經(jīng)外周致敏化機(jī)制的重要手段。大量研究發(fā)現(xiàn)TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，局部可釋放炎性介質(zhì)如P物質(zhì)、緩激肽、前列腺素E2、降鈣素基因相關(guān)肽等[13～15]。分布于消化道壁的初級(jí)傳入纖維末梢受到這些炎性介質(zhì)的刺激活化，將感覺(jué)信號(hào)放大傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。BDNF可能與上述炎性介質(zhì)共同協(xié)作參與炎性內(nèi)臟高敏感的調(diào)控。本研究結(jié)果證實(shí)，TNBS誘導(dǎo)炎癥后兩種不同基因型小鼠DRG內(nèi)BDNF表達(dá)均增加，同時(shí)伴有結(jié)腸高敏感。結(jié)腸炎后BDNF+/-小鼠BDNF表達(dá)明顯低于BDNF+/+小鼠，同時(shí)結(jié)腸敏感性亦低于BDNF+/+小鼠。提示BDNF參與結(jié)腸炎后的內(nèi)臟致敏。而在非炎癥狀態(tài)下，低壓力 CRD時(shí)，BDNF+/+和 BDNF+/-小鼠之間AWR評(píng)分無(wú)明顯差異，這可能源自于BDNF的生物學(xué)特性。BDNF在DRG中主要分布于中小直徑的神經(jīng)元，而中小直徑神經(jīng)元發(fā)出Aδ和C類纖維，傳遞傷害性感覺(jué)，為高閾值感受器[17]，因此非炎癥狀態(tài)時(shí)BDNF部分敲除對(duì)于較低壓力的非傷害性結(jié)腸刺激無(wú)明顯抑制作用，可能由BDNF高閾值感受器的特性所致。

臨床上IBD和IBS患者除反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉等消化道癥狀外，常伴有尿頻、尿急、尿痛等膀胱高反應(yīng)性的并發(fā)癥。目前觀點(diǎn)認(rèn)為這種腹腔臟器的癥狀重疊可能來(lái)自于支配不同臟器的神經(jīng)在DRG水平的 “集合”（convergence）[18]。應(yīng)用逆行熒光示蹤技術(shù)，標(biāo)記小鼠DRG內(nèi)來(lái)自膀胱和結(jié)腸的神經(jīng)元，證實(shí)兩者在 TL DRG（T13-L1）和 LS DRG（L5-S1）內(nèi)存在一定比例的重合[19]。作為感覺(jué)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的“門控”，研究參與DRG水平神經(jīng)元“集合”的關(guān)鍵分子對(duì)揭示牽涉性膀胱高敏感具有重要意義。

Qin等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸炎模型膀胱壁無(wú)組織病理學(xué)改變。本研究中，以TNBS建立小鼠結(jié)腸炎模型，亦發(fā)現(xiàn)膀胱無(wú)炎癥表現(xiàn)，組織結(jié)構(gòu)正常完整；BDNF+/-炎癥小鼠的膀胱敏感性顯著低于BDNF+/+炎癥小鼠，而在非炎癥狀態(tài)下，BDNF部分敲除對(duì)膀胱敏感性無(wú)明顯影響。提示BDNF可能在DRG水平參與牽涉性膀胱高敏感的發(fā)生，其作用趨向于調(diào)控者而非始發(fā)因子，且調(diào)控作用可能亦需在結(jié)腸炎癥狀態(tài)下由多種炎性介質(zhì)的刺激和協(xié)同作用而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究通過(guò)應(yīng)用BDNF基因敲除小鼠，證實(shí)BDNF參與結(jié)腸炎后結(jié)腸高敏感和牽涉性膀胱高敏感的發(fā)生，為研制針對(duì)腹痛癥狀的藥物提供了一定的理論依據(jù)。

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