張觀坡 高 峻 李桂香 李兆申 鄒多武*

第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科（200433）

腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）損傷是臨床上較為常見的基本病理生理過程，可在出血性休克、小腸移植、機械性腸梗阻和嚴重外傷等過程中發(fā)生[1]，會引起嚴重的并發(fā)癥甚至死亡，但目前仍缺乏有效的治療藥物。硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）是一種繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三類氣體信號分子，包括人在內(nèi)的哺乳動物可代謝生成內(nèi)源性H2S。Liu等[2]和Henderson等[3]均證實腸缺血后再灌注前給予H2S，可減輕I/R對腸黏膜上皮的損傷。目前尚未見H2S能否保護I/R后腸運動功能的報道。本研究通過探討H2S對腸I/R后回腸收縮活性的影響及其機制，旨在為腸I/R的治療提供一種潛在的藥物。

材料與方法

一、實驗動物、主要儀器、試劑

24只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，體質量180～250 g，適應性飼養(yǎng)1周。

BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、普通刺激銀電極（成都泰盟軟件有限公司），JH-2肌張力傳感器（航天醫(yī)學工程研究所），IX71 熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）。KCl（上海凌峰化學試劑有限公司），乙酰膽堿（Ach）、硫氫化鈉（NaHS）、河豚毒素（TTX）（Sigma 公司），驢封閉血清（Invitrogen公司），小鼠抗Hu單克隆抗體（Molecular Probes），山羊抗膽堿乙酰轉移酶（ChAT）多克隆抗體（Millipore），488 標記的驢抗小鼠熒光二抗（Invitrogen公司），Cy3標記的驢抗山羊熒光二抗（Jackson ImmunoResearch）。

二、方法

1.腸I1h/R4h模型的制備：SD大鼠禁食不禁水18 h，7%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，開腹分離腸系膜上動脈并用無創(chuàng)動脈夾夾閉，可見腸系膜上動脈分支遠端搏動消失，小腸由紅色轉變?yōu)榘咨珴u而轉變?yōu)樯钏{色。1 h后開腹取下動脈夾，可見腸系膜上動脈恢復前向性血流，遠端分支出現(xiàn)動脈搏動，小腸由深藍色恢復為紅色，合并充血、水腫?？p合腹腔，再灌注 4 h[4]。

2.動物分組和實驗設計：將24只SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、I/R組、H2S組,每組各6只。正常組麻醉后直接取材；假手術組麻醉開腹后僅用器械翻動小腸；I/R組行腸I1h/R4h造模，再灌注前20 min予腹腔內(nèi)注射0.9%NaCl溶液（0.5 mL/100 g）；H2S組行腸I1h/R4h造模，再灌注前20 min予腹腔內(nèi)注射2 mmol/L NaHS溶液（0.5 mL/100 g，終濃度為 10 μmol/kg）。

三、功能學實驗

1.組織取材：SD大鼠以7%水合氯醛麻醉后開腹，距回盲部3 cm處取回腸2～3 cm，立刻置入冷的 KRB 液中（通 95%O2、5%CO2混合氣體），修剪成1.0～1.5 cm的腸段。

2.離體回腸自發(fā)收縮實驗：腸段垂直掛入裝有KRB 液的恒溫浴槽中（10 mL，37 ℃，通 95%O2、5%CO2混合氣體），一端固定，另一端連接肌張力傳感器，等長收縮模式，予1 g前負荷平衡60 min（每隔15 min更換KRB液）。記錄離體回腸自發(fā)收縮頻率，計算自發(fā)收縮的曲線下面積（area under curve,AUC）。

3.離體回腸藥理學實驗：離體腸段予1 g前負荷平衡60 min后，加入3 mol/L KCl溶液100 μL（終濃度為30 mmol/L）。洗脫藥物3次，腸段收縮穩(wěn)定回歸基線后加入1 mmol/L Ach溶液100 μL（終濃度為10-5mol/L）。記錄離體回腸對KCl和Ach的最大收縮張力。

4.離體回腸電場刺激（electrical field stimulation,EFS）實驗：離體腸段予1 g前負荷平衡60 min后，將普通刺激銀電極的兩極平行置于腸段的漿肌層，待收縮穩(wěn)定后，給予EFS實驗（30 V，10 Hz，1.00 ms，10 s）。記錄離體回腸對EFS的最大收縮張力。

5.數(shù)據(jù)采集和計算：自發(fā)收縮頻率和AUC取自發(fā)收縮穩(wěn)定后3 min的平均值。AUC和最大收縮張力通過肌條橫截面積（cross section area,CSA）進行校正[5]：CSA（mm2）=組織濕重（mg）/[組織長度（mm）×組織密度（mg/mm3）]。 采用 Spike2 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

四、免疫熒光實驗

SD大鼠麻醉開胸，經(jīng)左心室至升主動脈插管，依次灌注0.9%NaCl溶液和4%多聚甲醛，取末端回腸約1 cm，剝離黏膜層和黏膜下層，保留漿肌層，繼續(xù)剝離環(huán)形肌，得到縱行肌腸肌間神經(jīng)叢標本。以0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次，加入含0.2%Triton的10%驢封閉血清30 min封閉非特異性抗原，加入Hu抗體和ChAT抗體（工作濃度分別為 1∶200 和 1∶100），4 ℃孵育過夜； 以 0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次，加入二抗（工作濃度分別為1∶400 和 1∶100）， 室溫下避光孵育 1 h；0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次。熒光顯微鏡下觀察，每只大鼠取 6張鋪片，每張鋪片隨機取2個視野（×200），采用Image-Impro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算Hu陽性神經(jīng)元細胞數(shù)；計算ChAT陽性神經(jīng)面積、累積光密度（IOD）值[6]。

五、統(tǒng)計學分析

結 果

一、大鼠離體回腸自發(fā)收縮頻率和AUC

與假手術組相比，I/R組和H2S組的自發(fā)收縮頻率無明顯差異，而后兩組之間亦無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、表 1）。

與假手術組相比，I/R造模后離體回腸的自發(fā)收縮AUC顯著降低（P=0.00）；給予H2S干預后，離體回腸的自發(fā)收縮AUC顯著提高（P=0.01），但仍顯著低于假手術組（P=0.001）（見表 1）。

二、大鼠離體回腸對KCl和Ach的收縮反應

與假手術組相比，I/R組和H2S組離體回腸對KCl和ACh誘發(fā)的最大收縮張力均無明顯差異（P>0.05），而后兩組之間相比亦無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、圖 2）。

三、大鼠離體回腸對EFS的反應

與假手術組相比，I/R組對EFS誘發(fā)的最大收縮張力明顯降低（P=0.00）；而給予I/R模型H2S干預后，EFS誘發(fā)的最大收縮張力顯著提高（P=0.02），與假手術組相比無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、圖 2）。

四、Hu免疫熒光染色

免疫熒光染色示Hu抗體陽性神經(jīng)元位于肌間神經(jīng)叢腸神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體大小不等，形態(tài)多樣，多數(shù)呈卵圓形、梭形（見圖3）。與假手術組相比，I/R組肌間神經(jīng)叢腸神經(jīng)元數(shù)目明顯下降（P=0.00）；給予H2S干預后，腸神經(jīng)元數(shù)目顯著提高（P=0.00），但仍顯著低于假手術組（P=0.00）（見表 1）。

五、ChAT免疫熒光染色

免疫熒光染色示，ChAT抗體可使膽堿能神經(jīng)元和神經(jīng)纖維染色，但神經(jīng)元邊界不甚清楚，辨認較為困難，而神經(jīng)纖維縱橫交錯，清晰易辨別（見圖4）。與假手術組相比，I/R組興奮性膽堿能神經(jīng)面積和IOD值明顯降低（P=0.00）；給予H2S干預后，這兩項指標均顯著提高（P=0.00），但仍顯著低于假手術組（P=0.00）（見表 1）。

表1 各組大鼠離體回腸自發(fā)收縮頻率和AUC、免疫熒光染色結果比較（）

表1 各組大鼠離體回腸自發(fā)收縮頻率和AUC、免疫熒光染色結果比較（）

*與假手術組比較，P<0.05；#與I/R組比較，P<0.05

ChAT抗體陽性神經(jīng)IOD值正常組 6 29.00±0.63 58.61±7.79 36.55±1.21 5.18±0.30 898624.81±26265.85假手術組 6 28.67±1.21 54.10±4.89 34.33±1.64 5.23±0.40 815937.50±82704.78 I/R 組 6 29.83±1.16 28.45±2.14* 20.23±1.33* 2.42±0.20* 404990.70±45093.09*H2S 組 6 29.33±1.21 38.85±9.18*# 29.41±1.14*# 4.23±0.42*# 592828.43±120340.38*#組別 例數(shù) 自發(fā)收縮頻率（次/min）AUC（g·min/mm2）Hu抗體陽性神經(jīng)元數(shù)目（個/視野）ChAT抗體陽性神經(jīng)面積（×104μm2）

討 論

胃腸道動力是由 Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal,ICC）、平滑肌和腸神經(jīng)共同調控的，腸I/R可通過引起腸神經(jīng)元、平滑肌細胞、ICC的凋亡而引起小腸運動功能障礙，尤其是腸神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能腸神經(jīng)受損從而引起興奮性神經(jīng)遞質Ach減少是最重要的原因之一。腸I/R可引起小腸自發(fā)收縮活性降低，但其對KCl、Ach收縮反應的研究結果不相一致[4,7]，且不同的I/R造模時間對其自發(fā)收縮頻率的影響亦不相同[8]。這可能與I/R造模方法不同有關。本研究采用無創(chuàng)動脈夾夾閉腸系膜上動脈1 h后再灌注4 h以制備腸I/R模型（I1h/R4h），其自發(fā)收縮頻率與假手術組相比無明顯改變，提示ICC起搏功能無明顯損傷；KCl誘發(fā)的最大收縮張力無明顯改變，提示平滑肌收縮功能無明顯損傷；Ach誘發(fā)的最大收縮張力無明顯改變，提示M受體及其介導的平滑肌收縮功能無明顯損傷。I/R組離體回腸自發(fā)收縮AUC以及對EFS收縮反應下降。本研究的預實驗中，離體腸段接受EFS后再給予TTX（1 μmol/L）阻斷神經(jīng)傳遞，發(fā)現(xiàn) EFS效應消失，證明EFS效應主要通過神經(jīng)網(wǎng)絡傳遞擴散，其刺激誘發(fā)的最大收縮張力明顯下降提示腸神經(jīng)尤其是興奮性腸神經(jīng)受到明顯損傷。Hu蛋白是一組神經(jīng)元特異性抗原，ChAT可催化合成Ach，可作為膽堿能神經(jīng)元的標記物。進一步免疫熒光結果亦提示，I/R組肌間神經(jīng)叢Hu抗體陽性神經(jīng)元數(shù)目以及興奮性膽堿能ChAT陽性神經(jīng)面積和IOD值較假手術組均明顯降低，表明I/R組腸神經(jīng)尤其是興奮性腸神經(jīng)元受到損傷。

H2S是一種第三類氣體信號分子，哺乳動物的內(nèi)源性H2S主要以半胱氨酸為底物，由胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase,CSE）代謝生成，在生理濃度下發(fā)揮多種重要的生理功能，如在神經(jīng)系統(tǒng)中可易化海馬長時程增強，在心血管系統(tǒng)中可直接舒張肺、體循環(huán)血管等[9]。近來，多項研究證實缺血前給予H2S，可在多種臟器如心[10]、肺[11]、肝[12]、腎[13]的I/R模型中起保護作用。其機制可能是：H2S通過局部可逆抑制細胞色素c氧化酶而阻斷氧化磷酸化；細胞氧化還原狀態(tài)的改變誘導黃嘌呤介導的抗氧化和抗凋亡途徑，繼而使組織細胞和器官處于低代謝狀態(tài)，提高對缺血的耐受性[3,14]。上述研究結果均提示預防性給予H2S可顯著減輕I/R損傷，但在臨床上多數(shù)I/R事件是無法預知的。因此，研究缺血發(fā)生后再給予H2S是否仍具有減輕臟器損傷的作用更具有臨床意義。

本研究誘導大鼠腸缺血后，于再灌注前20 min腹腔注射2 mmol/L NaHS溶液作為干預手段，結果顯示H2S組自發(fā)收縮AUC較I/R組明顯提高，提示H2S對腸I/R后的運動功能有保護作用；同時發(fā)現(xiàn)，H2S組對EFS誘發(fā)的最大收縮張力較I/R組明顯提高，提示H2S可減輕興奮性腸神經(jīng)的損傷。免疫熒光結果亦證實，與I/R組相比，H2S組肌間神經(jīng)叢Hu陽性神經(jīng)元數(shù)目以及興奮性膽堿能腸神經(jīng)面積和IOD值均明顯提高，提示H2S對腸I/R后運動功能保護作用的主要機制為減輕神經(jīng)元尤其是興奮性神經(jīng)元的損傷。有研究[2,3]證實，腸缺血后再灌注前給予H2S可減輕I/R對腸黏膜上皮的損傷作用，其機制可能與抗氧化物酶如超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（GSH-Px）活性升高相關。閆興軍等[15]進一步證實H2S對腸I/R大鼠腸黏膜屏障功能障礙有保護作用，其部分機制是減少中性粒細胞浸潤和激活，減輕腸上皮細胞氧化損傷水平，增加SOD清除氧自由基的活性，下調活化的caspase-3和多聚ADP核糖合成酶（PARP）蛋白表達。本研究初步證實腸缺血后再灌注前給予H2S具有保護離體回腸收縮活性的作用。由此可見，H2S不僅可以預防I/R損傷，而且在損傷發(fā)生后仍具有緩解損傷的作用。

總之，本研究證實了H2S對大鼠腸I/R后離體回腸的收縮功能有保護作用，其機制主要為減輕腸神經(jīng)尤其是興奮性腸神經(jīng)元的損傷。然而，H2S在不同組織、不同濃度下表現(xiàn)出截然不同的多種生物學效應，其作為一種潛在治療藥物尚需行更廣泛和深入的研究進一步證實。

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