汪之沫 王文峰 龍艷芹 汪 歡 錢 偉 侯曉華

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科（430022）

感染后腸易激綜合征（postinfectious irritable bowel syndrome,PI-IBS）系指急性胃腸道感染治愈后，部分患者仍存在腸道動(dòng)力和感覺異常，出現(xiàn)腹痛、腹瀉、便秘等腸道相關(guān)癥狀。研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS患者腸黏膜固有層T細(xì)胞浸潤增多，伴炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等表達(dá)增加[1,2]；T 細(xì)胞數(shù)量減少后，IBS癥狀隨之減輕[3]。本課題組的前期研究[4]通過建立旋毛蟲感染后內(nèi)臟高敏感小鼠模型模擬人類PI-IBS的自然過程，發(fā)現(xiàn)模型小鼠腸黏膜固有層樹突細(xì)胞（DC）誘導(dǎo)活化Th17細(xì)胞與腸道感染消退后腸黏膜免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活有關(guān)，源自模型小鼠腸黏膜固有層的DC與脾臟CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)能誘導(dǎo)其分化為Th17細(xì)胞，使IL-17分泌增多。關(guān)于DC活化Th17細(xì)胞的具體機(jī)制，目前仍不甚清楚，推測可能與DC分泌IL-23有關(guān)。本研究應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)抑制DC分泌IL-23，通過觀察經(jīng)小鼠IL-23小發(fā)夾RNA（shRNA）干擾的DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞功能的變化，探討感染后內(nèi)臟高敏感小鼠腸黏膜固有層DC活化Th17細(xì)胞的機(jī)制，以進(jìn)一步明確DC在腸道感染消退后腸黏膜免疫系統(tǒng)持續(xù)激活中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和造模

雄性SPF級NIH小鼠由武漢生物制品研究所提供，6～8 周齡，體質(zhì)量（25.0±2.3） g，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。旋毛蟲幼蟲由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供。

12只NIH小鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只。對照組以0.2 mL 0.9%NaCl溶液灌胃；模型組以0.2 mL含300條旋毛蟲幼蟲的0.9%NaCl溶液灌胃[5]。8周后處死兩組小鼠，取腸道和脾臟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)過程中無動(dòng)物死亡。

小鼠處死前行結(jié)腸氣囊擴(kuò)張腹壁回撤反射（AWR）評分，處死后取空腸、末端回腸、近端結(jié)腸、遠(yuǎn)端結(jié)腸標(biāo)本行組織病理學(xué)檢查，判斷模型組小鼠感染后內(nèi)臟高敏感模型建立是否成功。具體步驟參照本課題組前期研究[4]。

二、腸黏膜固有層DC和脾臟CD4+T細(xì)胞的分離純化

模型組小鼠處死后浸泡于75%乙醇中3 min，于超凈臺內(nèi)取全部空腸、回腸和結(jié)腸，PBS充分沖洗，剪成0.5 cm×0.5 cm左右的片狀，參照本課題組前期研究[4]步驟獲取腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞，以MACS?CD11c 免疫磁珠（Miltenyi Biotec）分選DC，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。所獲細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示CD11c陽性率為78.85%±10.11%，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活性≥90%。

另取脾臟研碎，參照本課題組前期研究[4]步驟獲取單個(gè)核細(xì)胞，以MACS?CD4免疫磁珠（Miltenyi Biotec）分選CD4+細(xì)胞，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。所獲細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示CD4陽性率為98.40%±1.82%，臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞活性≥99%。

三、小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

設(shè)計(jì)、合成能產(chǎn)生小鼠IL-23 shRNA的兩條互補(bǔ)單鏈DNA模板（A鏈和B鏈），A鏈序列為5′-CACCAGCAGCTCTCTCGGAATCTTTCAAGACG AGATTCCGAGAGAGCTGCT TTTTTT G-3′，B 鏈序列為 5′-AGCT C AAAAAA AGCAGCTCTCTCGGAATCT CGTCTTGAA AGATTCCGAGAGAGCTGCT-3′，由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成。A鏈與B鏈互補(bǔ)結(jié)合后形成雙鏈DNA模板，結(jié)構(gòu)為CACC+正義序列+發(fā)夾環(huán)序列+反義序列+終止信號序列+SacⅠ，其中正義序列AGCAGCTCTCTCGGAATCT與小鼠IL-23基因p19亞基的一段序列同源，經(jīng)BLAST同源序列比對，不與小鼠基因組其他基因序列同源。模板兩端引入酶切位點(diǎn)黏端序列以便于與載體連接。同時(shí)設(shè)計(jì)、合成能產(chǎn)生與小鼠IL-23基因無同源序列的無關(guān)序列shRNA的兩條互補(bǔ)單鏈DNA模板作為對照。

分別以30 μL退火緩沖液溶解合成的1 OD（1 OD DNA=50 ng/μL DNA）A 鏈和 B 鏈基因片段，各取 2 μL，加入 16 μL 退火緩沖液混勻，94 ℃水浴退火，自然冷卻至室溫。取1 μL退火連接產(chǎn)物，加入99 μL H2O作100倍稀釋，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以Eco31Ⅰ酶切線性化pGenesil-1.1質(zhì)粒表達(dá)載體，1%瓊脂糖凝膠電泳回收大片段。將上述稀釋退火片段與質(zhì)粒pGenesil-1.1連接，連接反應(yīng)體系內(nèi)含稀釋退火片段1 μL、質(zhì)粒pGenesil-1.11 μL、10×連接緩沖液 1 μL、T4 DNA 連接酶 1 μL 和 H2O 6 μL，37℃水浴反應(yīng)過夜。取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kanar抗性（終濃度30 μg/mL）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落接種于5 mL含Kanar抗性（終濃度30 μg/mL）的 LB 培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫?fù)u床（7×g）培養(yǎng)過夜。

以質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]小量提取質(zhì)粒，SacⅠ酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系內(nèi)含質(zhì)粒 DNA 8.5 μL、10×酶切緩沖液 1 μL 和SacⅠ 0.5 μL，37 ℃水浴反應(yīng) 3 h，1%瓊脂糖凝膠電泳。如酶切鑒定顯示切下預(yù)期大小的片段，則送含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌液測序（華大基因）。如測序正確，以質(zhì)粒大提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]大量提取質(zhì)粒，測定濃度后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、DC轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置IL-23 shRNA組（A組）、空脂質(zhì)體組（B組）和無關(guān)序列shRNA組（C組），每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。分離純化得到的腸黏膜固有層DC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，接種于6孔板，待細(xì)胞匯合率達(dá)90%時(shí)，以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（InvitrogenTM,Life Technologies Corporation）轉(zhuǎn)染相應(yīng)干擾質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物或空脂質(zhì)體，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后備用。收集各組DC轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后24 h培養(yǎng)上清液，以備檢測IL-23水平。此步驟重復(fù)3次。

五、轉(zhuǎn)染后DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)

A、B、C 三組分別計(jì)數(shù) 5×105個(gè) DC，與 1.5×106個(gè)CD4+T細(xì)胞接種于12孔板，以含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基定容至1 mL，另設(shè)置CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組（D組），每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)120 h后收集各組培養(yǎng)上清液，以備檢測IL-17水平。此步驟進(jìn)行3次，分別使用3次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的DC。

六、IL-23、IL-17 水平檢測

步驟四、步驟五收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-23、IL-17水平的檢測采用ELISA方法（BioSourceTM,Life Technologies Corporation），操作按試劑盒說明書進(jìn)行，每一標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、感染后內(nèi)臟高敏感小鼠模型建立

模型組小鼠感染旋毛蟲后8周，肉眼觀未見腸道水腫，光學(xué)顯微鏡下未見腸黏膜破壞和明顯炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)腸氣囊擴(kuò)張壓力為40和60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）時(shí)，模型組 AWR均分顯著高于對照組（40 mm Hg:2.41±0.26 對 1.39±0.16,P<0.01;60 mm Hg:3.23±0.37 對 2.72±0.23,P<0.05），個(gè)體最低AWR均分（40 mm Hg:2.28±0.19,60 mm Hg:3.15±0.18）亦顯著高于對照組（P<0.05）。 表明腸道感染消退后，小鼠內(nèi)臟敏感性持續(xù)增高，提示造模成功。

二、構(gòu)建質(zhì)粒的酶切鑒定

質(zhì)粒pGenesil-1.1的多克隆位點(diǎn)為：-MluⅠ-hU6 promoter-Insert DNA-SacⅠ-，本研究在插入的目的基因片段里設(shè)計(jì)有一個(gè)SacⅠ酶切位點(diǎn)，且質(zhì)粒pGenesil-1.1本身就有一個(gè)SacⅠ酶切位點(diǎn)，如插入正確，質(zhì)粒就能被SacⅠ酶切出一條約1000 bp的DNA片段。經(jīng)SacⅠ酶切鑒定，所構(gòu)建的小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒和無關(guān)序列shRNA干擾質(zhì)粒均符合設(shè)計(jì)要求（見圖1）。

三、小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒的測序分析

測序分析結(jié)果顯示所構(gòu)建質(zhì)粒中小鼠IL-23 shRNA模板DNA序列與設(shè)計(jì)序列完全一致（見圖2）。

四、DC培養(yǎng)上清液IL-23水平

轉(zhuǎn)染小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒的DC，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)上清液中的IL-23水平較轉(zhuǎn)染前顯著降低；轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體或無關(guān)序列shRNA干擾質(zhì)粒的DC，轉(zhuǎn)染前后IL-23水平無明顯變化（見表1）。

表1 DC轉(zhuǎn)染前后培養(yǎng)上清液IL-23水平比較（,pg/mL）

表1 DC轉(zhuǎn)染前后培養(yǎng)上清液IL-23水平比較（,pg/mL）

*與同組轉(zhuǎn)染前比較，P<0.05

五、轉(zhuǎn)染后DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-17水平

CD4+T細(xì)胞與轉(zhuǎn)染小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒、空脂質(zhì)體或無關(guān)序列shRNA干擾質(zhì)粒的DC共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)上清液中的IL-17水平均較單獨(dú)培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞顯著增高[(12.63±0.63)pg/mL、(14.31±0.44)pg/mL 和(14.22±0.53)pg/mL 對(11.15±0.93)pg/mL,P<0.05]，其中IL-23 shRNA組顯著低于空脂質(zhì)體組和無關(guān)序列shRNA組（P<0.05），空脂質(zhì)體組和無關(guān)序列shRNA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

PI-IBS是常見功能性腸病IBS的主要亞型，近年研究發(fā)現(xiàn)PI-IBS患者的腸黏膜存在由T細(xì)胞介導(dǎo)的持續(xù)低度炎癥[1,2]。DC是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最重要的抗原呈遞細(xì)胞，腸黏膜固有層中存在大量未成熟的DC，攝取抗原后轉(zhuǎn)化為成熟DC。DC在向CD4+T細(xì)胞呈遞抗原的同時(shí)，還能分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化。

CD4+Th細(xì)胞作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的一個(gè)大類，在機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等諸多方面發(fā)揮重要作用。Th細(xì)胞可分為Th1、Th2、Th17三個(gè)亞群，三者均由初始型CD4+T細(xì)胞分化而成；作為Th17細(xì)胞產(chǎn)生的代表性細(xì)胞因子，IL-17與自身免疫性疾病密切相關(guān)，參與了相關(guān)疾病組織炎癥的調(diào)節(jié)[6～8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)IL-17在T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性腸道炎癥的維持中發(fā)揮重要作用。PI-IBS患者的腸黏膜處于持續(xù)低度炎癥狀態(tài)，因此Th17細(xì)胞可能參與了此種低度炎癥狀態(tài)的維持。

旋毛蟲感染后內(nèi)臟高敏感小鼠模型可模擬人類PI-IBS的自然過程[5]，目前已廣泛應(yīng)用于PI-IBS的研究。本課題組的前期研究[4]顯示，小鼠感染旋毛蟲后2周，腸黏膜可見典型急性炎癥改變，結(jié)腸氣囊擴(kuò)張AWR評分提示內(nèi)臟敏感性增高；感染后8周，腸黏膜已無明顯炎癥改變，但AWR評分提示內(nèi)臟敏感性持續(xù)增高。感染旋毛蟲后8周，小鼠腸黏膜固有層DC與脾臟CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)能顯著促進(jìn)IL-17分泌，作用強(qiáng)于感染后2周的腸黏膜固有層DC。上述結(jié)果表明在急性炎癥期，腸黏膜固有層DC能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞并使之活化，隨著腸道炎癥的自愈，該作用并不減弱，反而進(jìn)一步增強(qiáng)，即腸道感染消退后，DC仍能持續(xù)有效地活化Th17細(xì)胞，這一作用可能對PI-IBS腸黏膜免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活具有重要意義。

關(guān)于PI-IBS時(shí)腸黏膜固有層DC活化Th17細(xì)胞的具體機(jī)制，目前仍不甚清楚。研究[10]發(fā)現(xiàn)回腸末端菌群可刺激黏膜固有層DC產(chǎn)生IL-23。IL-23是一個(gè)由p19亞基和IL-12p40亞基組成的異源二聚體，屬于IL-12細(xì)胞因子家族成員[11]，是誘導(dǎo)初始型CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞并分泌IL-17的關(guān)鍵細(xì)胞因子[6～8]。推測PI-IBS時(shí)腸黏膜固有層DC可能系通過分泌IL-23刺激CD4+T細(xì)胞分化，誘導(dǎo)活化Th17細(xì)胞，參與腸道感染消退后腸黏膜免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活。

RNA干擾作為一種高效、特異的基因干預(yù)工具，目前已廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。p19亞基為IL-23發(fā)揮特異性作用的關(guān)鍵亞基，外周血DC、極化的Th1細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞中均可檢測到高水平p19表達(dá)。因此本研究以小鼠IL-23基因p19亞基的一段序列為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建了小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒，以高效、特異地沉默小鼠IL-23基因。酶切鑒定和測序分析顯示小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，目的序列完全正確。模擬人類PI-IBS的感染后內(nèi)臟高敏感小鼠模型腸黏膜固有層DC轉(zhuǎn)染小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒后，培養(yǎng)上清液中的IL-23水平較轉(zhuǎn)染前顯著降低，而轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體或無關(guān)序列shRNA干擾質(zhì)粒的DC轉(zhuǎn)染前后IL-23水平無明顯變化，證明所構(gòu)建的小鼠IL-23 shRNA干擾質(zhì)粒能有效抑制腸黏膜固有層DC的IL-23表達(dá)。經(jīng)RNA干擾抑制IL-23表達(dá)的DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，雖然亦能促進(jìn)IL-17分泌，但作用顯著弱于IL-23表達(dá)未受抑制（轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體或無關(guān)序列shRNA干擾質(zhì)粒）的DC。由此推測感染后內(nèi)臟高敏感小鼠腸黏膜固有層DC可能通過分泌IL-23刺激CD4+T細(xì)胞分化，誘導(dǎo)活化Th17細(xì)胞，參與維持腸道感染消退后腸黏膜免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活；在PI-IBS腸黏膜免疫系統(tǒng)激活的過程中，可能存在著DC-IL-23-Th17-IL-17這一免疫激活通路，當(dāng)然這并不是惟一的通路。這一發(fā)現(xiàn)對進(jìn)一步認(rèn)識PI-IBS的發(fā)病機(jī)制以及探索新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

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