郭艷華，李艾華，張玉敏

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

酚類是天然化合物中的一個大類，廣泛存在于不同結(jié)構(gòu)、不同種類的植物中，其中一些酚類化合物是眾所周知的抗氧化劑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)副產(chǎn)品（如茶葉、花生殼、柑橘類果皮、果汁殘渣等）的提取物中也含有豐富的多酚類物質(zhì)，其中有些提取物中多酚含量很高。因此來自農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)副產(chǎn)品的植物多酚將成為保健食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)的重點開發(fā)研究對象［1-3］。至今，對荸薺的加工副產(chǎn)品荸薺皮中多酚的研究未見報道。本文研究超聲優(yōu)化荸薺皮多酚的提取工藝，并研究其粗提物的脂質(zhì)抗氧化作用，為天然生物廢棄資源的深度開發(fā)和利用提供科學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑 原料：荸薺皮（收集于武漢市鄂城墩集貿(mào)市場）。

試劑：焦性沒食子酸、茶多酚、β-胡蘿卜素等為生化試劑；無水乙醇、MnO4、FeCl3、溴水、硫代巴比妥酸（TBA）、NaOH（固體）、濃鹽酸、石油醚、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、Tween-40、亞油酸等均為分析純。

1.1.2 主要儀器 721分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV—2401紫外可見分光光度計，日本島津公司；RE—52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；ST-02A多功能粉碎機，永鑫市帥通工具有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；DFll0型電子分析天平，中國輕工業(yè)機械總公司常熟衡器公司；KQ-250型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 荸薺皮多酚的提取方法 將荸薺皮破碎，過60目篩，粉碎后加入約10倍體積的石油醚浸提12 h脫脂，室溫下干燥至恒質(zhì)量。以提取多酚含量作為指標，進行初步的單因素實驗。在單因素提取實驗中，超聲波輔助提取時間為50 min時多酚含量最為突出，故提取時間單因素不必作為正交因素水平，在單因素實驗中即可確定提取時間為50 min。綜合考慮其它單因素水平乙醇濃度、液料比和提取液的酸度，設(shè)計正交實驗因素水平表（見表1），以確定最佳提取條件。單因素實驗的結(jié)果：提取劑酸度pH為3.5，提取劑乙醇濃度為60%，料液比為1∶20（g∶mL）。

表1 正交實驗因素水平表

根據(jù)正交實驗最佳條件提取荸薺皮多酚，過濾后減壓濃縮至膏狀，根據(jù)測定的需求濃度用要求的溶劑定容，即為荸薺皮多酚提取物。

1.2.2 酚類物質(zhì)的顯色鑒定 取少量荸薺皮的提取液，分別加入 ① 溴水、② KMnO4溶液、③FeCl3溶液，進行檢測。

1.2.3 紫外-可見光譜的測定 稱取1.00 g荸薺皮粉于錐形瓶中，根據(jù)正交實驗最佳條件取荸薺皮多酚提取物1 mL于比色管中，用50%乙醇稀釋至刻度，用1 cm的比色皿測其紫外吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。

圖1 荸薺皮提取液的吸收光譜

1.2.4 多酚含量的測定 （1）沒食子酸標準曲線的繪制。利用沒食子酸標準溶液和Folin試劑等測定并制作沒食子酸標準曲線［4］。以吸光度 A為橫坐標，總酚濃度C（mg/mL）為縱坐標建立標準曲線，回歸方程：C=7.9234A-0.0157，相關(guān)系數(shù) R=0.9999。（2）荸薺皮多酚提取物中總酚含量的測定。以提取液代替沒食子酸標準溶液按照制作標準曲線的方法測定提取物中的總酚含量。

1.2.5 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性的測定

（1）對亞油酸/β-胡蘿卜素實驗。采用β-胡蘿卜素褪色實驗測定荸薺皮提取物抗油脂氧化能力［5］。以1.0 mL 氯仿溶解0.5 mg β-胡蘿卜素，加入200 mg Tween-40和25 μL亞油酸，均勻混合后蒸干。加入100 mL蒸餾水，振蕩均勻。取4 mL上述混合液，加入200 μL提取物樣品溶液，于50℃加熱3 h。以常用抗氧化劑BHT和茶多酚作對照實驗。測定反應(yīng)前后樣品在波長490 nm處的吸光度?？寡趸芰Π聪率竭M行計算：

式中：A0，A0′分別為初始樣品和對照組的吸光度；At，At′分別為3 h后樣品和對照組的吸光度。抑制率越大，對亞油酸脂質(zhì)氧化的抑制作用越強。

（2）對Fe2+催化亞油酸脂質(zhì)過氧化體系的抗氧化作用測定。在pH=7.4的10 mL 0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液中，加入2.5%的亞油酸乙醇液4.2 mL，蒸餾水4.8 mL，再加入Fe2+（［Fe2+］=2.54 ×10-3g/L）溶液1 mL，使Fe2+催化亞油酸形成底物溶液。加入底物質(zhì)量濃度為0.05%、0.10%和0.15%的荸薺皮乙醇提取物、茶多酚和BHT，混合后在40℃的生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)16 h，取出，迅速加入25%的三氯乙酸混勻。然后加入0.67%的TBA，在沸水浴中加熱15 min。取出冷卻，加入4 mL正丁醇，混勻，離心15 min，取正丁醇液于532 nm比色，同時測定不加抗氧化物的吸光度。

研究表明：亞油酸氧化的起始反應(yīng)很慢，但微量的過渡金屬離子可起催化作用。當向亞油酸中加入Fe2+時，除了可以加速起始反應(yīng)外，還可與脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化物（LOOH）反應(yīng)，使其分解產(chǎn)生烷氧基（LO·）和脂質(zhì)過氧自由基（LOO·），從而加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)的進行。亞油酸的氧化產(chǎn)物過氧化物可分解產(chǎn)生二級產(chǎn)物丙二醛，丙二醛與硫代巴比妥酸作用生成有色染料，最大吸收波長為532 nm。由吸光值的大小可判斷丙二醛產(chǎn)生的多少，并評估各樣品在催化條件下的抗氧化效果。抗氧化樣品加入可清除自由基，抑制丙二醛的產(chǎn)生，吸光度越小，抗氧化活性越強。清除率計算公式如下：

清除率/%=［(A0-At)/(A0)］×100%，

其中：A0為不加樣品的吸光度值，At為加樣品后的吸光度值。

（3）對Fenton反應(yīng)催化亞油酸脂質(zhì)過氧化體系的抗氧化作用測定。在pH=7.4的10 mL 0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液中，加入2.5%的亞油酸乙醇液4 mL，蒸餾水4.4 mL，再加入Fe2+（［Fe2+］=2.54×10-3g/L）溶液1 mL和0.5 mL 0.01%的H2O2催化亞油酸形成底物溶液。其余方法同1.2.5的方法（2）。

1.2.6 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系測定 將超聲輔助法最佳提取物溶液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，配制系列荸薺皮多酚含量不同的溶液，然后測定對亞油酸/β-胡蘿卜素實驗的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取荸薺皮多酚的正交實驗結(jié)果

超聲波法提取荸薺皮多酚的正交實驗結(jié)果見表2。由表2可以看出，在3個因子中，以提取劑濃度對提取率的影響最大；各因子對提取率的影響依次為提取劑濃度、提取劑酸度、料液比。確定最佳工藝條件為60%乙醇，提取劑酸度pH=3.5，料液比為1∶30（g/mL），提取時間為單因素實驗確定的50 min，此條件提取的多酚得率1.8%。查得 F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00，由表3可知，3種影響因素均為不顯著性影響因子。

表2 L933正交表和實驗結(jié)果

表3 正交實驗方差分析

2.2 荸薺皮多酚的顯色反應(yīng)結(jié)果

按照1.2.2的方法進行試驗，得到酚類物質(zhì)定性初步鑒定結(jié)果（表4）。根據(jù)酚類物質(zhì)的顯色反應(yīng)特征，說明荸薺皮提取物中含酚類物質(zhì)［7-8］。

表4 酚類物質(zhì)顯色反應(yīng)結(jié)果

2.3 紫外—可見吸收光譜的測定

按1.2.3實驗方法測得荸薺皮多酚粗提液紫外—可見吸收光譜見圖1。

荸薺皮粗提液的吸收光譜中有3個吸收峰，峰Ⅰ為303.00 nm，峰Ⅱ為286.50 nm，峰Ⅲ為205.00 nm，而在可見區(qū)無明顯吸收，這正是植物中多酚類物質(zhì)的吸收光譜特征［9］。

2.4 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性測定結(jié)果

2.4.1 對亞油酸/β-胡蘿卜素實驗結(jié)果與分析

由圖2得知，在亞油酸/β-胡蘿卜素自氧化體系中，荸薺皮多酚提取物、茶多酚、BHT均有明顯的抑制作用，荸薺皮多酚提取物和茶多酚抑制能力相當，但不如BHT。在10～80 mg/L濃度范圍內(nèi)，三者的抑制能力明顯增大，而當濃度為100～300 mg/L濃度范圍內(nèi)，抑制作用緩慢增大。

圖2 荸薺皮提取物對亞油酸/β-胡蘿卜素自氧化體系的抑制作用

2.4.2 對Fe2+催化亞油酸脂質(zhì)過氧化體系的抗氧化作用的測定結(jié)果 由表5可知，荸薺皮提取物對催化條件下亞油酸的脂質(zhì)過氧化物有抗氧化作用，且隨提取物濃度的增強抗氧化性增強，荸薺皮提取物的抗氧化作用強于同濃度的天然抗氧化劑茶多酚，但不及同濃度的合成抗氧化劑BHT。

表5 荸薺皮提取物在Fe2+催化條件下的抗氧化作用/%

圖3 荸薺皮提取物的脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系

2.4.3 對Fenton反應(yīng)催化亞油酸脂質(zhì)過氧化體系的抗氧化作用的測定結(jié)果 此反應(yīng)體系中，F(xiàn)e2+除了催化起始反應(yīng)，與過氧化物形成LO·LOO·自由基外，還可以與H202反應(yīng)，產(chǎn)生高活性的氫氧自由基·OH，加速氧化反應(yīng)的進行。提取物對Fenton反應(yīng)催化下脂質(zhì)過氧化的抑制作用結(jié)果見表6?？梢娸┧j皮提取物對該體系也有一定的抗氧化作用，與茶多酚的能力接近。多酚的特征，初步可判斷荸薺皮提取物中含有多酚類物質(zhì)。

3）荸薺皮多酚提取物具有較強的脂質(zhì)抗氧化活性，在對亞油酸的不同體系中，抗氧化能力強于或接近于茶多酚，弱于合成的抗氧化劑BHT。

4）荸薺皮是食品加工廢棄生物資源，研究說明其中含有較強的抗氧化性物質(zhì)，是值得開發(fā)利用的新資源。

表6 荸薺皮提取物在Fenton反應(yīng)催化條件下的抗氧化作用/%

2.5 荸薺皮多酚提取物脂質(zhì)抗氧化活性與多酚含量的關(guān)系測定

按1.2.6實驗測定的結(jié)果見圖3。結(jié)果表明：荸薺皮提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力與其提取物中多酚含量有一定關(guān)聯(lián)性，但并未呈完全關(guān)聯(lián)性，說明其中還有其它種類的物質(zhì)具有抗氧化作用，有待于今后進一步研究。

3 結(jié)論

1）超聲輔助提取荸薺皮中多酚的最佳條件是：提取劑乙醇濃度為60%，提取劑酸度pH=3.5，料液比為1∶30（g/mL），提取時間為50 min。

2）經(jīng)顯色反應(yīng)和紫外可見吸收光譜的測定，荸薺皮提取物顯色反應(yīng)和紫外可見吸收光譜具有

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