齊曉彥，李 春，張 微，劉 寧，*

(1.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心(國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心)，黑龍江哈爾濱 150086; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

黑木耳多糖-乳清蛋白復(fù)合物的制備及其抗原性的研究

齊曉彥1，2，李 春2，+，張 微1，劉 寧1，2，*

(1.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心(國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心)，黑龍江哈爾濱 150086; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030)

蛋白質(zhì)和多糖在控制條件下通過美拉德反應(yīng)會發(fā)生一定程度的共價復(fù)合，能顯示更優(yōu)越的性能。采用黑木耳多糖作為糖基供體，用糖基化的手段與牛乳中乳清蛋白結(jié)合形成木耳多糖－乳清蛋白復(fù)合物，并在現(xiàn)有的條件下探索不同質(zhì)量比與不同反應(yīng)時間對糖基化進(jìn)程的影響，采用間接競爭ELISA法測定復(fù)合物中β－乳球蛋白和α－乳白蛋白抗原性的影響。結(jié)果表明，乳清蛋白與黑木耳多糖質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時間為24h，是糖基化反應(yīng)最佳條件并且能有效減低乳清蛋白抗原性，其中β－乳球蛋白抗原性降低率為75.7%，α－乳白蛋白抗原性降低率為25%。

黑木耳多糖，多糖提取，乳清蛋白，美拉德反應(yīng)，抗原性

Key words: auricularia auricula polysaccharides; polysaccharides extraction;whey p rotein; Maillard reac tion;antigenicity

嬰兒配方乳粉中主要的成分是乳清蛋白粉，其中β－乳球蛋白占乳清蛋白的48%，α－乳白蛋白占19%，乳蛋白過敏的人中大約有82%對β－乳球蛋白過敏［1］。如何通過蛋白質(zhì)改性降低乳蛋白的過敏性是近幾年國內(nèi)外的研究熱點。糖基化法與酶解法和化學(xué)方法比較，使乳清蛋白改性，更好地降低其過敏性。其中相關(guān)研究已證實多糖能有效減低乳清蛋白過敏性［2－6］，而國內(nèi)外關(guān)于單糖或低聚糖使蛋白糖基化改善致敏性的研究也比較多［7－8］。實際應(yīng)用中單糖或低聚糖進(jìn)行糖苷化后的效果并不理想。而Arita K等人［9］以多糖的復(fù)合方式降低大豆蛋白致敏性。黑木耳(Auricularia auricula)，它能提供豐富的多糖，而且由多種組分組成，如水溶性β－D－葡聚糖(葡聚糖Ⅰ)、水不溶性β－D－葡聚糖(葡聚糖Ⅱ)和兩種酸性雜多糖［10］，進(jìn)一步通過紙層析和氣相層析分析發(fā)現(xiàn):黑木耳酸性雜多糖組成成分有D－木糖、D－甘露糖、D－葡萄糖和D－葡萄糖醛酸及少量的L－巖藻糖和L－阿拉伯糖［11］。因此，本研究通過提取黑木耳多糖并將其作為糖基供體，探索其對乳清蛋白抗原性的影響，為糖基化能有效降低牛乳過敏性的研究提供基本的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

六周齡BALB/c雌性小鼠 哈爾濱市獸醫(yī)研究所;黑木耳 實驗室自制;乳清蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.1%) 新西蘭;β－乳球蛋白(β－LG)、α－乳白蛋白(α－LA) Sigma公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 博奧森公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、鄰苯二甲醛(OPA) 國藥集團(tuán)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

包被液:濃度為 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6;稀釋液:濃度為 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH7.4;洗滌液:磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.05% Tween－20;封閉液:磷酸鹽緩沖液(PBS)+5%脫脂乳;終止液:濃度為2mol/L的濃硫酸;自制抗體及酶標(biāo)記抗體:抗原:分別為β－LG、α－LA、WPI和WPIAAP復(fù)合物;酶標(biāo)二抗:HRP－羊抗鼠IgG(1∶1000)?？贵w:小鼠抗β－LG血清(1∶12800)和小鼠抗α－LA血清(1∶3200)。

UT－1800紫外－可見分光光度計 北京瑞利; DK－8K恒溫水浴鍋 上海博迅;Alpha 1－2/LD plus凍干機(jī) 德國CHRIST公司;ZFQ85B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀杭州藍(lán)天;TGL－16C臺式離心機(jī) 上海離心機(jī)械研究所;550型酶標(biāo)儀 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑木耳多糖的提取工藝流程 原料預(yù)處理→90℃水浴浸提1h→微波加熱10min→4500r/min離心取上清→50℃減壓濃縮→Sevage法3次脫蛋白→95%乙醇醇沉→離心取沉淀→無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌沉淀→復(fù)溶→蒸餾水透析48h→冷凍干燥24h→精制多糖(AAP)。

1.2.2 苯酚－硫酸法測定多糖含量

1.2.2.1 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液分別配制成16～72μg/m L，9個樣品中加6%苯酚1m L，98%濃硫酸5m L放置10m in，然后在490nm下測定吸光值。

1.2.2.2 樣品中多糖含量的測定 吸取多糖提取液1m L，定容至100m L，按上述步驟操作測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算多糖含量。

1.2.3 木耳多糖－乳清蛋白復(fù)合物的制備 將木耳多糖和乳清蛋白按照質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶4、1∶8溶解于磷酸鹽緩沖液中，制成60g/L的溶液，在－20℃中預(yù)凍過夜后，冷凍干燥48h。干燥后樣品磨細(xì)，放置于培養(yǎng)皿中，用刺孔的鋁箔封口后放置于裝有溴化鉀的飽和溶液(相對濕度79%)的反應(yīng)器中，溫度分別控制在50℃反應(yīng)0～30h，室溫下冷卻，即為乳清蛋白糖基復(fù)合物。

1.2.4 褐變程度測定 將待測的樣品用去離子水進(jìn)行稀釋，使溶液的質(zhì)量濃度為1g/L，并在420nm條件下測定其吸光值。

1.2.5 游離氨基酸殘留量的測定 采用鄰苯二甲醛法(OPA)［12－13］。OPA試劑的配制:稱取40mg OPA溶于1m L甲醇中，分別加入濃度為0.1mol/L的硼砂25m L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS 2.5m L及100μLβ－巰基乙醇，用去離子水定容至50m L。現(xiàn)用現(xiàn)配。將樣品液(質(zhì)量濃度為1g/L)取200μL稀釋液加入4m L的OPA試劑中，混合后室溫下反應(yīng)1～2m in，340nm下測定其吸光度。以 L－亮氨酸濃度0～5.0×10－3mol/L制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出樣品的游離氨基酸殘留量的濃度。

1.2.6 抗β－乳球蛋白及α－乳白蛋白多克隆抗體的制備 取10只6周齡健康雌性BALB/c小鼠，首次免疫取(β－LG或α－LA)1.0mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)液與等量弗氏完全佐劑充分混勻，每只小鼠0.1m L，腹腔注射。第14和28d換成不完全弗氏佐劑同法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫原的量不變。一周后加強(qiáng)免疫，摘除眼球采血，分離血清，非競爭ELISA法測定抗體效價，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 木耳多糖－乳清蛋白抗原性的測定 采用間接競爭ELISA法［14］。抗原包被:用包被液稀釋抗原，100μL/孔加入酶標(biāo)板中，4℃過夜備用。抗原與初級抗體反應(yīng):在反應(yīng)管中加入一定量的待測樣品或抗原(β－LG或α－LA)和一定量稀釋的小鼠血清。不加抗原或樣品的反應(yīng)管作為無競爭體系。4℃冰箱過夜。洗滌:恢復(fù)至室溫傾去包被液，加 PBST 200μL/孔，洗板3次，每次5m in，扣干。封閉:每孔加200μL 5%脫脂乳粉作為封閉液，37℃保溫1h，以PBST洗滌，扣干。競爭反應(yīng):將第一步中抗原或抗體的混合物100μL/孔，于37℃孵育1.5h。洗滌:用PBST洗板3次，扣干。加酶標(biāo)二抗:每孔加入100μL 1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。洗滌:用PBST洗板3次，扣干。顯色:加入TMB顯色液100μL/孔，37℃暗處反應(yīng)15～20m in，顯示藍(lán)色。終止反應(yīng):每孔加50μL 2mol/L濃硫酸以終止反應(yīng)，顏色變黃。比色:用酶聯(lián)免疫檢測雙波長(特征波長490nm，非特征波長630nm)各孔吸光值。通?？乖越档吐视靡韵鹿奖硎?

式中:A樣品和AWPI分別指包被抗原為糖基化產(chǎn)物和WPI反應(yīng)體系孔在特征波長492nm和非特征波長630nm測得的吸收值的差。

1.2.8 統(tǒng)計分析 文中所列數(shù)據(jù)至少為3組數(shù)據(jù)的平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳多糖含量的檢測

糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(圖1):Y=0.0173X－0.0091，相關(guān)系數(shù)R2≈0.9953。其中，Y表示溶液在490nm處的吸光值。X表示溶液中葡萄糖的含量(μg)。通過苯酚－硫酸法測定木耳多糖含量，得到精制的黑木耳多糖的多糖含量為76.7%。

2.2 木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比與反應(yīng)時間對復(fù)合物的影響

L－亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程(圖2)為Y= 0.2531X+0.0271，相關(guān)系數(shù)R2≈0.9976。式中:Y表示溶液在490nm處的吸光值。X表示L－亮氨酸濃度(mol/L)。游離氨基酸殘留量即為糖基化發(fā)應(yīng)后的復(fù)合物中游離氨基酸濃度與未反應(yīng)的WPI中游離氨基酸的濃度的比值。

圖1 苯酚－硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve by phenol－sulfuric acid method

圖2 L－亮氨酸濃度Fig.2 The concentration of L－leucine

控制反應(yīng)條件為相對濕度79%，溫度為50℃，木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，反應(yīng)時間為0～30h，對復(fù)合物褐變指數(shù)以及游離氨基酸殘留量的影響分別為如圖3～圖4所示。

統(tǒng)計結(jié)果表明，反應(yīng)時間對復(fù)合物的影響顯著(p＜0.05)。由圖可看出，隨著糖基化的反應(yīng)時間越長，褐變指數(shù)逐漸增加，游離氨基酸殘留量逐漸減少，表明發(fā)生了糖基化反應(yīng)。當(dāng)時間小于24h，時間對反應(yīng)進(jìn)程的影響顯著(p＜0.05)，但是隨著時間增加變化趨于平緩，所以確定反應(yīng)時間為24h。

由圖3～圖4可知，4種不同質(zhì)量比的復(fù)合物隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的變化趨勢基本相似。在實驗范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，褐變程度增加，但是增大的趨勢較為平緩，且不同質(zhì)量比的復(fù)合物差異不明顯。而游離氨基酸殘留量呈逐漸降低的趨勢，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，反應(yīng)時間24h時，游離氨基酸殘留量分別為37.9%、41.6%、62.4%、68.9%，進(jìn)一步說明，黑木耳多糖中的小分子還原性糖和乳清蛋白的美拉德反應(yīng)發(fā)生很快，在短時間內(nèi)就可以達(dá)到。適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量比不僅可提高反應(yīng)速度，還可減少副反應(yīng)發(fā)生。當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時，游離氨基酸殘留量消耗較多，且褐變程度隨時間延長增加不明顯，因此木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比為1∶1較好。

2.3 木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比與反應(yīng)時間對復(fù)合物抗原性的影響

利用間接競爭ELISA法測定反應(yīng)時間及不同質(zhì)量比對β－乳球蛋白和α－乳白蛋白抗原性降低率，結(jié)果如圖5～圖6所示。不同質(zhì)量比對β－乳球蛋白抗原性降低率的影響顯著(p＜0.05)。由圖5可以看出，隨著乳清蛋白與木耳多糖的質(zhì)量比不斷增加，β－乳球蛋白抗原性降低率明顯下降，木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比為1∶1時能夠最大程度上降低β－乳球蛋白的抗原性，降低率最高可達(dá)到75.7%。

圖3 不同質(zhì)量比對復(fù)合物褐變程度的影響Fig.3 Effect ofmass ratio on the degree of browning

圖4 不同質(zhì)量比對復(fù)合物游離氨基殘留量的影響Fig.4 Effect of differentmass ratio on the degree of free amino group content

反應(yīng)時間小于12h時，β－乳球蛋白的抗原性變化比較平緩，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到24h時，β－乳球蛋白的抗原性最為顯著，隨著時間的延長β－乳球蛋白的抗原性又稍有降低。說明木耳多糖對降低乳清蛋白的過敏性有所影響，反應(yīng)時間最佳為24h。美拉德反應(yīng)生成的木耳多糖－乳清蛋白產(chǎn)物改變了抗原活性部位。

圖5 不同質(zhì)量比和反應(yīng)時間對β－乳球蛋白抗原性的影響Fig.5 Antigenicity ofβ－LG through different reaction time and mass ratio

不同質(zhì)量比對α－乳白蛋白抗原性降低率的影響顯著(p＜0.05)。相對于β－乳球蛋白抗原性的降低率，圖6中不同質(zhì)量比和反應(yīng)時間對α－乳白蛋白抗原性降低率偏低，相同的是木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時間為24h時，α－乳白蛋白的抗原性降低率達(dá)到為25%，但是隨著反應(yīng)時間的延長在30h時α－乳白蛋白的抗原性降低率達(dá)到最高為35.7%。達(dá)到24h時，α－乳白蛋白和β－乳球蛋白抗原性降低率均達(dá)到達(dá)到最高，其中β－乳球蛋白是α－乳白蛋白的抗原性降低的2倍以上，這可能由于乳清蛋白中的β－乳球蛋白和α－乳白蛋白具有不同分子結(jié)構(gòu)和過敏原表位產(chǎn)生的結(jié)果［15］。

圖6 不同質(zhì)量比和反應(yīng)時間對α－乳白蛋白抗原性的影響Fig.6 Antigenicity ofα－LA through different reaction time and mass ratio

3 結(jié)論

單因素實驗結(jié)果表明，木耳多糖和乳清蛋白的質(zhì)量比為1∶1時，反應(yīng)時間為24h的條件下，木耳多糖－乳清蛋白復(fù)合物中游離氨基酸殘留量為37.9%，且褐變程度僅為0.21。在此反應(yīng)條件下，采用間接競爭ELISA法檢測，木耳多糖與乳清蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)能有效減低乳清蛋白中β－乳球蛋白和α－乳白蛋白的抗原性，其中木耳多糖對β－乳球蛋白的作用比較明顯，反應(yīng)時間為24h時降低率達(dá)到75.7%，而α－乳白蛋白的抗原性變化不明顯，反應(yīng)時間為24h時僅為25.0%，但α－乳白蛋白在反應(yīng)時間為30h時抗原性達(dá)到最高為35.7%。本研究提取物黑木耳多糖能有效的降低乳清蛋白的抗原性，綜合以上因素，以抗原性低和最大程度上保持復(fù)合物的功能特性，最佳的反應(yīng)條件為黑木耳多糖和乳清蛋白質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時間為24h。

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Study on preparation and antigenicity activity of glycosylation products derived from whey protein and auricularia auricula polysaccharide

QIXiao－yan1，2，LIChun2，+，ZHANG W ei1，LIU Ning1，2，*
(1.Heilongjiang Dairy Technical Development Center(National Dairy Engineering＆Technology Research Center)，Harbin 150086，China;2.College of Food Science＆Technology，Key Lab of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Protein and polysaccharide covalent com p lex through Maillard could form p rotein－polysaccharide conjugations which showed excellent p roperties.And the conjugates of whey p rotein and auricularia auricula polysaccharides(AAP)were stud ied by means of the d ry－h(huán)eating g lycosylated reac tion.Itwas shown thatafter the whey p rotein and Auricularia auricula polysaccharides(AAP)of d ifferentmass ratio reac ting for d ifferent tim e，the antigenicity ofβ－LG andα－LA were estimated by ind irect com petition ELISA.The results ind icated that the g lycolsylation ofwhey p rotein could reduce the antigenicity ofβ－LG andα－LA.The op timum reac tion cond ition were WPIand AAP(1∶1 weight ratio)for 24 hours could reduce the antigenicity of whey p rotein effec tively，The antigenicity of bovine m ilkβ－LG andα－LA was reduced by conjugation w ith AAP，about 75.7%and 25% respectively.

TS252.1

B

1002－0306(2012)19－0232－04

2012－03－27 *通訊聯(lián)系人;+為并列第一作者。

齊曉彥(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品營養(yǎng)與乳品加工方向。

李春(1977－)，男，博士，研究方向:乳品加工。

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAD09B03);黑龍江省教育廳(11551062)。