劉桃芳, 湯 華, 鞏 偉, 孫 鵬, 劉寶姝, 李 玲, 張 文(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物研究中心, 上海 200433)

·論著·

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30873200，41076082).上海市科委生物醫(yī)藥重點(diǎn)項(xiàng)目(10431902400).上海市浦江人才項(xiàng)目(PJ2008).

劉桃芳(1984-)，男，碩士研究生.E-mail:liu5012004008@sian.com.cn.

張 文.Tel:(021)81871257,E-mail:wenzhang1968@136.com.

中國南海紫柳珊瑚中倍半萜成分的研究

劉桃芳, 湯 華, 鞏 偉, 孫 鵬, 劉寶姝, 李 玲, 張 文
(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物研究中心, 上海 200433)

目的研究南海紫柳珊瑚Muriceopsisflavida的化學(xué)成分。方法應(yīng)用正相硅膠、Sephadex LH-20凝膠、半制備RP-HPLC等多種色譜手段進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法對(duì)化合物進(jìn)行體外抗微生物活性測(cè)試。結(jié)果從南海紫柳珊瑚中分離得到2個(gè)愈創(chuàng)木烷內(nèi)酯型倍半萜，分別鑒定為menverins C(1)及D(2)。體外活性測(cè)試表明這兩個(gè)化合物有不同程度的抗微生物活性，它們對(duì)巨大芽孢桿菌及微藻分別顯示相當(dāng)強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)論化合物1, 2為首次從該屬珊瑚中分離得到。Menverins C及D所表現(xiàn)出來的抗微生物作用，說明這些化合物在紫柳珊瑚的化學(xué)生態(tài)防御過程中可能具有重要的生態(tài)學(xué)功能。

紫柳珊瑚；化學(xué)成分；倍半萜；結(jié)構(gòu)鑒定

柳珊瑚俗稱海扇、海鞭或海柳，系海洋無脊椎低等動(dòng)物，我國海洋中分布有7科，78種，主要分布在福建、廣東沿海及南海海域[1]。國際上對(duì)柳珊瑚化學(xué)成分的研究始于20世紀(jì)60年代。1969年，美國學(xué)者Weinheiner等從柳珊瑚中發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)及生理活性的前列腺素前體[2]，這一重要發(fā)現(xiàn)引起了天然產(chǎn)物化學(xué)家的廣泛關(guān)注，并直接導(dǎo)致了第一次海洋天然產(chǎn)物研究的熱潮。到目前為止，已從柳珊瑚中分離得到了眾多結(jié)構(gòu)新穎且具有良好生物學(xué)活性的化合物，包括脂類、萜類、甾體類、生物堿、鯊肝醇、核苷酸類等[3～5]。

紫柳珊瑚Muriceopsisflavida俗稱紫海柏，屬腔腸動(dòng)物門(Coelenterata)珊瑚蟲綱(Anthozoa)八放珊瑚亞綱(Octocorallia)柳珊瑚目(Gorgonacea)叢柳珊瑚科(Plexauridae)動(dòng)物，主要分布在太平洋東部及加勒比海海域。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)僅1篇對(duì)該種柳珊瑚化學(xué)成分的研究報(bào)道，從中分離得到5個(gè)4-甲基化甾醇[6]。為開發(fā)利用我國的海洋生物資源，研究海洋生物的生態(tài)活性物質(zhì)、尋找具有生物活性及藥用前景的海洋天然產(chǎn)物，我們多年來一直對(duì)南海柳珊瑚的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究,并發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)各異的次級(jí)代謝產(chǎn)物[7～11]。作為課題組對(duì)南海柳珊瑚化學(xué)成分系統(tǒng)研究的一部分，本實(shí)驗(yàn)對(duì)南海紫柳珊瑚的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到5個(gè)過氧化甾醇[12]。對(duì)該珊瑚化學(xué)成分的進(jìn)一步研究，我們又從中分離得到兩個(gè)高度氧化的不飽和愈創(chuàng)木烷內(nèi)酯型倍半萜(1, 2)[13,14]，其化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1，2的結(jié)構(gòu)

1 材料和方法

1.1樣品 實(shí)驗(yàn)樣品于2008年7月采自廣西北海海域水下10 m處，立即冷凍備用。種屬由中國科學(xué)院南海海洋研究所李秀保助理研究員鑒定，樣品標(biāo)本保存于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院海洋藥物研究中心，編號(hào)ZS-17。

1.2主要儀器和試劑 NMR(Bruker Avance-400)；MΑT-212質(zhì)譜儀；柱色譜硅膠(200～300目、400～600目)和TLC薄層板均由煙臺(tái)黃務(wù)芝罘硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠提供；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠由Pharmacia公司提供；HPLC [Aglient 1100，RID檢測(cè)器，Zorbax 300-C18柱(250 mm×9.4 mm)]，開放柱色譜所用試劑均為分析純，HPLC所用試劑為色譜純，均由中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。

1.3化合物的提取分離 將濕重1.4 kg的紫柳珊瑚樣品切碎，用丙酮超聲提取，每次2 L，提取6次至無色，合并提取液并減壓濃縮至干，得丙酮粗提物10.2 g，將粗提物用1 L蒸餾水混懸，依次用等體積乙醚和正丁醇萃取4次，合并萃取液并減壓濃縮至干，分別得乙醚層浸膏7.3 g及正丁醇層浸膏1.8 g。乙醚層浸膏(7.3 g)經(jīng)硅膠柱色譜梯度洗脫(石油醚：乙酸乙酯99：1～100%乙酸乙酯)，將其分成14個(gè)部分(Fr.1～Fr.14)。Fr.9 (600 mg)再經(jīng)過正相硅膠柱色譜(400～600目硅膠；正己烷: 丙酮 = 6:1、4:1、3:1、2:1梯度洗脫)、Sephadex LH-20凝膠柱色譜 (CHCl3:MeOH = 2:1)、RP-HPLC (C18柱，流動(dòng)相：92%甲醇-水；流速：1.5 ml/min；柱溫：30 ℃)進(jìn)一步純化，收集保留時(shí)間為27 min時(shí)的流份，減壓回收至干，得化合物1 (5.0 mg)，收集保留時(shí)間為31 min時(shí)的流份，減壓回收至干，得化合物2 (4.0 mg)。

2 結(jié)果

2.1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1化合物1的結(jié)構(gòu) 無色油狀，硫酸-香草醛顯紫紅色，ESI-MS (m/z)準(zhǔn)分子離子峰為263.3 ([M+H]+)，結(jié)合1H-NNR、13C-NMR、DEPT推測(cè)其分子式為C15H18O4?；衔?的波譜數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.72 (1H, ddd,J=1.6, 8.3, 13.2 Hz, Hα-2)，2.38 (1H, ddd,J=3.0, 9.1, 13.2 Hz, Hβ-2)，2.58 (1H, m, Hα-3)，2.48 (1H, m, Hβ-3)，3.13 (1H, brs, H-5)，2.71 (1H, ddd,J=1.9, 12.2, 18.5 Hz, Hα-6)，2.91 (1H, dd,J=3.9, 18.5 Hz, Hβ-6)，5.65 (1H, s, H-9)，1.93 (3H, d,J=1.9 Hz, H-13)，5.05 (1H, d,J=1.6 Hz, Hα-14)，4.89 (1H, d,J=1.6 Hz, Hβ-14)，1.55 (3H, s, H-15)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 85.2 (s, C-1)，34.2 (t, C-2)，29.8 (t, C-3)，154.2 (s, C-4)，42.8 (d, C-5)，26.4 (t, C-6)，148.3 (s, C-7)，149.2 (s, C-8)，116.3 (d, C-9)，73.5 (s, C-10)，127.6 (s, C-11)，169.9 (s, C-12)，8.9 (q, C-13)，107.1 (t, C-14)，26.1 (q, C-15)。結(jié)合文獻(xiàn)[13, 14]，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為menverin C。

2.1.2化合物2的結(jié)構(gòu) 無色油狀，硫酸-香草醛顯紫紅色，ESI-MS (m/z)準(zhǔn)分子離子峰為263.3 ([M+H]+)，結(jié)合1H-NNR、13C-NMR、DEPT推測(cè)其分子式為C15H18O4。觀察碳譜氫譜核磁數(shù)據(jù)可知化合物2與化合物1結(jié)構(gòu)非常相似，對(duì)照文獻(xiàn)[13]可知化合物2是化合物1的異構(gòu)體，區(qū)別僅在于兩個(gè)化合物的C-1上的羥基構(gòu)型不同，化合物2的結(jié)構(gòu)命名為menverin D。其波譜數(shù)據(jù)為：1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.76 (1H, ddd,J=1.6, 7.7, 13.3 Hz, Hα-2)，2.01 (1H, ddd,J=7.7, 7.9, 13.3 Hz, Hβ-2)，2.35 (1H, dd,J=7.9, 15.2 Hz, Hα-3)，2.60 (1H, m, Hβ-3)，2.72 (1H, brs, H-5)，2.86 (1H, dd,J=4.5, 16.0 Hz, Hα-6)，3.11 (1H, dd,J=7.1, 16.0 Hz, Hβ-6)，5.85 (1H, s, H-9)，1.92 (3H, s, H-13)，5.02 (1H, s, Hα-14)，4.86 (1H, s, Hβ-14)，1.62 (3H, s, H-15)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 89.2 (s, C-1)，35.0 (t, C-2)，31.3 (t, C-3)，153.9 (s, C-4)，51.6 (d, C-5)，27.6 (t, C-6)，148.0 (s, C-7)，150.7 (s, C-8)，117.6 (d, C-9)，75.3 (s, C-10)，126.4 (s, C-11)，170.3 (s, C-12)，8.6 (q, C-13)，105.9 (t, C-14)，26.5 (q, C-15)。結(jié)合文獻(xiàn)[13, 14]，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為menverin D。

2.2體外活性測(cè)試 本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)法，以青霉素、鏈霉素、酮康唑?yàn)殛栃詫?duì)照，丙酮為陰性對(duì)照，測(cè)定了化合物1,2對(duì)革蘭陽性菌(巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium)，革蘭陰性菌(大腸桿菌Escherichiacoli)，兩種真菌(殼針孢葉枯病菌Septoriatritici、花藥黑粉菌Microbotryumviolaceum)，藻類(小球藻Chlorellafusca)的抑制活性。按時(shí)觀察結(jié)果，并測(cè)量抑菌圈大小(直徑大小)。測(cè)量3次，取平均值。

結(jié)果顯示，這些化合物對(duì)受試微生物的生長(zhǎng)均顯示不同程度的抑制活性，化合物1對(duì)巨大芽孢桿菌的抑制作用強(qiáng)于鏈霉素和酮康唑，化合物2對(duì)小球藻的抑制活性強(qiáng)于3個(gè)陽性對(duì)照藥。測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 瓊脂擴(kuò)散法抗菌、抗真菌及抗微藻活性篩選實(shí)驗(yàn)

注：受試樣品量為0.5 μg，以抑菌圈直徑為作用判定指標(biāo)(單位：cm)。

3 討論

柳珊瑚作為一種海洋無脊椎低等動(dòng)物，自身缺乏有效的物理防御能力，卻能分泌有效的化學(xué)防御物質(zhì)，用于抵抗病原菌及其他生物侵?jǐn)_，這些化學(xué)防御物質(zhì)新穎復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其表現(xiàn)出來的生物活性引起了化學(xué)、藥理學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

開展對(duì)紫柳珊瑚的化學(xué)成分研究有利于我國海洋生物資源開發(fā)，從中尋找具有生物活性及藥用前景的海洋天然產(chǎn)物。本研究從紫柳珊瑚中分離得到了2個(gè)高度不飽和的愈創(chuàng)木烷內(nèi)酯型倍半萜 menverins C及 D (1, 2)，這種高度不飽和的愈創(chuàng)木烷內(nèi)酯倍半萜之前只在類尖柳珊瑚科的3種動(dòng)物中Menellaverrucosa,Menella,Echinogorgiasassaporeticulate分離得到過[13～15]，這是首次從類尖柳珊瑚科之外的珊瑚中分離得到該類物質(zhì)。

對(duì)化合物1,2的抗真菌、細(xì)菌和微藻的體外活性測(cè)試表明，這兩個(gè)化合物對(duì)受試微生物均有一定程度的抗菌和抗藻活性，化合物1對(duì)巨大芽孢桿菌的抑制活性比陽性對(duì)照藥鏈霉素和酮康唑的活性強(qiáng)，對(duì)小麥殼針孢葉枯病菌的抑制活性要比青霉素和鏈霉素強(qiáng)，化合物2對(duì)小球藻的抑制活性要強(qiáng)于陽性對(duì)照藥鏈霉素和酮康唑，與陽性對(duì)照藥青霉素相當(dāng)，因此，化合物1和2在抗微生物活性方面，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。Menverins C及 D所表現(xiàn)出來的抗微生物作用，說明這些化合物在珊瑚的化學(xué)生態(tài)防御過程中可能具有重要的生態(tài)學(xué)功能。

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SesquiterpenesfromtheSouthChinaSeagorgonianMuriceopsisflavida

LIU Tao-fang, TANG Hua, GONG Wei, SUN Peng, LIU Bao-shu, LI Ling, ZHANG Wen
(Research Center for Marine Drugs, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

ObjectiveTo study the chemical constituents of the South China Sea gorgonianMuriceopsisflavida.MethodsThe compounds were isolated and purified by repeated column chromatographies including normal-phase silica gel, Sephadex LH-20 and semi-preparative RP-HPLC. The structures were elucidated by the physicochemical evidences and spectra data. The in vitro bio-activities of the compounds were assessed by an agar diffusion test.ResultsTwo sesquiterpenes were isolated and indentified as menverins C (1) and D (2). The two compounds showed different levels of antimicrobial activity in bioassay in vitro. In particular, compounds 1 and 2 displayed considerable growth inhibition toward bacteriumBacillusmigateriumand the algaChlorellafusca, respectively.ConclusionsThis was the first report of menverins C (1) and D (2) from the genusMuriceopsis. The antimicrobial activity of both compounds suggested a possible ecological role of these metabolites in the chemical defensive strategy of the gorgonian.

Muriceopsisflavida; chemical constituents; sesquiterpene; structure elucidation

R282.77

A

1006-0111(2012)02-0100-03

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.02.006

2011-05-27

[修回日期]2012-01-01