陳 乾，馬天翔，郭宏舉，史 寧，吳久鴻(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 30000；.解放軍第306醫(yī)院，北京 100101)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(3077263).

陳 乾(1982-)，男, 藥師,碩士研究生.

吳久鴻.Tel: (010)64879825, E-mail:jiuhongwu@hotmail.com.

硫酸鋇-比濁法測(cè)定褐藻糖膠中硫酸根的含量

陳 乾1.2，馬天翔2，郭宏舉2，史 寧2，吳久鴻2
(1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230000；2.解放軍第306醫(yī)院，北京 100101)

目的運(yùn)用硫酸鋇比濁法測(cè)定日高昆布中褐藻糖膠硫酸根的含量。方法采用硫酸鋇比濁法，通過分光光度計(jì)檢測(cè)到最大吸收波長(zhǎng)為360 nm；在此波長(zhǎng)下測(cè)定褐藻糖膠中硫酸根的含量。結(jié)果硫酸根在60～120 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.990 9)，測(cè)得褐藻糖膠中硫酸根的含量為(20.52±0.57)%;方法學(xué)符合測(cè)定要求。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、靈敏度較高，適用于海藻多糖硫酸根含量的測(cè)定。

褐藻糖膠；硫酸根；硫酸鋇比濁法

褐藻糖膠(fucoidan)又名褐藻多糖硫酸酯(sulfated fucans，F(xiàn)PS) ，是一種水溶性的硫酸雜多糖，普遍存在于褐藻中(如海帶、昆布、羊棲菜、裙帶菜等)。它是褐藻中所固有的細(xì)胞間質(zhì)多糖具有抗凝血、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫功能等多種重要的生物活性[1～5]，而硫酸根的存在對(duì)褐藻糖膠的物理化學(xué)性質(zhì)及生物活性都有重要影響。因此，定性、定量測(cè)定褐藻糖膠的硫酸根，對(duì)于鑒定褐藻糖膠樣品及分析構(gòu)效關(guān)系都有重要意義。常用的分析方法有硫酸鋇-比濁法、硫酸鋇-重量法、離子色譜法、聯(lián)苯胺法等[6]。這些方法中硫酸鋇-比濁法、硫酸鋇-重量法是最常用、最經(jīng)典的方法，硫酸鋇-重量法操作比較復(fù)雜而硫酸鋇-比濁法操作簡(jiǎn)單，在普通實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行且測(cè)定結(jié)果可靠穩(wěn)定，故而本實(shí)驗(yàn)選擇硫酸鋇-比濁法測(cè)定日高昆布中褐藻糖膠硫酸根含量。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑 日高昆布購(gòu)于日本北海道,經(jīng)上海市自然博物館杭金欣副研究員鑒定為L(zhǎng)aminariajaponicaAresch；硫酸鉀、三氯乙酸、氯化鋇、明膠、濃鹽酸、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.1.2儀器 BS110S、BS323S型電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；UV-2000型紫外分光光度計(jì)(上海洪富儀器儀表有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1褐藻糖膠的提取 取日高昆布，清水洗凈，風(fēng)干后磨成粉末過20目篩。稱取215 g的日高昆布藻粉用石油醚1 500 ml、90 ℃回流1 h，脫脂2次，離心(4 000 r/min，10 min)分離，沉淀揮發(fā)溶劑后，加入昆布質(zhì)量15倍的pH值為2的15 g/L氯化鈣溶液60 ℃浸提1.5 h。取上清液濃縮加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為65%沉淀，沉淀用乙醇和丙酮浸洗再離心，40 ℃干燥，得褐藻糖膠粗多糖16.16 g，得率為7.55%；粗多糖配制成2%多糖水溶液，用Sevag法去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，離心除去不溶物，加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為20%，離心除去沉淀，上清液繼續(xù)加乙醇至60%，離心，得沉淀；然后對(duì)60%乙醇沉淀物進(jìn)行重新沉淀，先加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為30%，留上清液去除沉淀，再加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為70%，溶液呈半膠體，加入1 ml 10%氯化鈉溶液后，迅速有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，沉淀用無水乙醇及丙酮浸洗，40 ℃真空干燥得純化的褐藻糖膠2.13 g，得率為0.994%[7，8]。

1.2.2褐藻糖膠樣品的處理 稱取褐藻糖膠樣品10 mg，于具塞試管，加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml于110 ℃加熱水解8 h，冷卻后，8 000 r/min離心20 min，過濾，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3紫外光譜的測(cè)定 精密稱取105 ℃干燥至衡重的硫酸鉀108.75 mg，以1 mol/L的鹽酸溶解，定容置100 ml容量瓶中，搖勻，即得硫酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液(SO42-=0.60 mg/ml)；取硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 ml,加三氯乙酸3.8 ml和氯化鋇溶液1 ml,混勻,進(jìn)行紫外光譜測(cè)定；結(jié)果硫酸鉀在360 nm處顯最大吸收峰。如圖1所示。

圖1 硫酸鹽的紫外光譜圖

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.04、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20 ml于試管，各以鹽酸溶液補(bǔ)至0.20 ml；以0.2 ml鹽酸溶液作為空白,加三氯乙酸3.8 ml和氯化鋇溶液l ml,混勻，室溫靜置25 min，于360 nm測(cè)吸收度A1；以5%的明膠溶液1.0 ml代替氯化鋇溶液依法操作,測(cè)吸收度A2,以硫酸根mg數(shù)為橫坐標(biāo),縱坐標(biāo)為吸收度(A1-A2)值,得標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍。其中每點(diǎn)做3個(gè)平行樣品，取平均值。

1.2.5硫酸根含量的測(cè)定 吸取樣品溶液0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測(cè)吸收度(A1-A2)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及換算因子計(jì)算硫酸根含量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度值見表1。以吸光度吸收度(A1-A2)值對(duì)硫酸根(mg)數(shù)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.877 4C-0.004 500,r2=0.990 9；SO42-在60～120 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸光度值(n=3)

2.2測(cè)定時(shí)間確定 取新鮮配制樣品溶液0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法操作，在不同時(shí)間檢測(cè)同一樣品SO42-含量，穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果同叢建波[9]、宮春宇等[10]報(bào)道的稍有不同，即在15～40 min之間測(cè)量結(jié)果比較穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定時(shí)間為25 min。

圖2 不同時(shí)間褐藻糖膠樣品中SO42-含量測(cè)定

2.3重復(fù)性試驗(yàn) 在不同時(shí)間分別取新鮮配制3批樣品溶液各0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法檢測(cè)SO42-的含量，檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性。測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，不同時(shí)間檢測(cè)樣品溶液SO42-含量沒有明顯差別，說明重復(fù)性較好；水解樣品在25 h內(nèi)測(cè)定差異較小(RSD=2.58%)。

2.4換算因子(f)測(cè)定 精密吸取硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.15 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作方法，測(cè)吸收度(A1-A2)值，由回歸方程求供試液中SO42-的含量，根據(jù)f=w/c計(jì)算換算因子f=1.02(W為所取SO42-質(zhì)量，C為SO42-測(cè)定質(zhì)量)。

2.5回收率試驗(yàn) 為檢驗(yàn)本方法的準(zhǔn)確性和可靠性，要進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。測(cè)定方法如下：取硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和褐藻糖膠樣品水解液組成2 ml加樣樣品液，然后吸取此加樣樣品液0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測(cè)吸收度(A1-A2)值，由回歸方程測(cè)定加樣樣品液硫酸根量,計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見表3。

回收率=[實(shí)測(cè)硫酸根(量)-樣品中的硫酸根(量)]/加入硫酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液(量)

表2 3批褐藻糖膠樣品中SO42-的含量測(cè)定結(jié)果(%)

表3 褐藻糖膠回收率檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

2.6樣品硫酸根含量測(cè)定 吸取樣品液0.2 ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法，測(cè)吸收度(A1-A2)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及換算因子計(jì)算硫酸根含量。其中，每個(gè)樣品測(cè)3次，取平均值。硫酸根含量(%)=[f×(C/0.2)×V/W]×100%，其中f為換算因子，C為樣品測(cè)定值(mg)，V為樣品水解液總體積，W為初始樣品質(zhì)量。結(jié)果見表4。

表4 褐藻糖膠的硫酸根含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1明膠中含有微量雜質(zhì)，當(dāng)加入氯化鋇配置l%氯化鋇-0.5%明膠溶液時(shí)，溶液成輕微乳濁液狀，可能是明膠中含有微量雜質(zhì)同鋇離子形成沉淀所致。因此，要離心處理l%氯化鋇-0.5%明膠溶液，這樣不僅可以獲得良好的重復(fù)性而且還可以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和穩(wěn)定性。重復(fù)性試驗(yàn)所用的硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液、褐藻糖膠樣品液都必須現(xiàn)配才能減少測(cè)量誤差。

3.2運(yùn)用硫酸鋇比濁法測(cè)定日高昆布中褐藻糖膠硫酸根的含量時(shí)，采用離心l%氯化鋇-0.5%明膠溶液，硫酸根在60～120 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.990 9)；有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[11]，硫酸鋇比濁法測(cè)SO42-的含量時(shí)，SO42-的含量在0～120 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示15 min前SO42-的含量會(huì)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，15～40min之內(nèi)SO42-的含量比較穩(wěn)定，而40 min以后隨時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定時(shí)間為25 min時(shí)檢測(cè)；測(cè)得日高昆布中褐藻糖膠硫酸根含量為(20.52±0.57)%,RSD=2.78%，方法學(xué)符合測(cè)定要求。

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Determinationofthesulfatecontentinsulfatedfucansbybariumsulfateturbidity

CHEN Qian1.2, MA Tian-xiang2, GUO Hong-ju2, SHI Ning2, WU Jiu-hong2
(1.Anhui Medical University, Hefei 230000, China; 2.306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China)

ObjectiveTo determine the sulfate content in sulfated fucans (FPS) by Barium sulfate turbidity.MethodsWith spectrophotometer at 360 nm, the sulfate content was determined by Barium Sulfate Turbidity.ResultsThere was a good linearity (r2=0.990 9) when the sulfate content was within the range of 60～120 μg. Sulfate content of FPS was (20.52±0.57)% under the determination method.Methodology met the measurement requirement.ConclusionThe method was proved to be reliable, quick, sensitive and applicable.

fucoidan; sulfated content; barium sulfate turbidity

R927.2

A

1006-0111(2012)02-0118-03

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.02.011

2011-09-15

[修回日期] 2011-12-01