王希營，朱全剛 ，高 靜 ，高 申 ，潘勇華 ，苗 鵬(.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 004， .第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 004， .蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 00)

國家十二五“重大新藥創(chuàng)制”專項(2011ZXJ09106-07B).

王希營(1982-)，男，碩士研究生.Tel:13508638614,E-mail:miss5700@sian.com.

高 申.Tel:(021)81873715,E-mail:liullk@126.com.

灌胃α-硫辛酸對豚鼠噪聲性聽力損傷的防護(hù)作用研究

王希營1，朱全剛1，高 靜2，高 申1，潘勇華1，苗 鵬3
(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433， 2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433， 3.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

目的觀察自由基清除劑α-硫辛酸對噪聲性聽力損傷的保護(hù)作用。方法24只體重為250～300 g的雄性純白色豚鼠，按體重隨機(jī)分為α-硫辛酸低、中、高劑量組(n=3×6)、噪聲對照組(n=6)。各組動物暴露倍頻程噪聲(4 kHz中心頻率)115 dB SPL(sound pressure level，聲壓級) 4 h。α-硫辛酸組動物暴露前2 d、暴露當(dāng)天至暴露后7 d連續(xù)灌胃給予α-硫辛酸30 mg/(kg·d)(低劑量組)、60 mg/(kg·d)(中劑量組)、120 mg/(kg·d)(高劑量組)；對照組動物相應(yīng)時間灌胃給予等量的生理鹽水。暴露后不同時間(3、7、10 d)測試各組動物在不同頻率(8、16、24、32 kHz)下的聽覺腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)值，組織學(xué)檢查內(nèi)外毛細(xì)胞缺失和損傷程度，以測試時的聽閾值與暴露前聽閾差值(聽閾偏移)反映聽力受損情況。結(jié)果暴露后3 d，低、中、高劑量組在8、16 kHz頻率下，與噪聲對照組相比較具有顯著性差異；低、高劑量組在24、32 kHz頻率下與噪聲對照組相比較具有顯著性差異；暴露后7 d，中、高劑量組在8、16、24 kHz頻率下與噪聲對照組相比較具有顯著性差異；低、高劑量組在32 kHz頻率下與噪聲對照組相比較具有顯著性差異；暴露后10 d，高劑量組與噪聲對照組比較具有顯著性差異。組織學(xué)檢查，α-硫辛酸組動物無明顯內(nèi)外毛細(xì)胞缺失，毛細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞較輕。對照組動物內(nèi)耳外毛細(xì)胞顯示水腫、空泡變性等病變。結(jié)論高、中、低劑量的α-硫辛酸對噪聲性聽力損傷均有一定的預(yù)防作用；高劑量的α-硫辛酸對噪聲性聽力損傷具有很好的預(yù)防和治療作用。

噪聲性聽力損傷；聽覺腦干反應(yīng)；α-硫辛酸；保護(hù)作用；預(yù)防作用

噪聲是一種常見的危害人類身心健康的環(huán)境因素。研究表明，噪聲暴露會影響耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞，使其ATP需要量增加，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的耗氧量、耗葡萄糖量增加，出現(xiàn)局部相對缺血，破壞耳蝸的抗氧化體系，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)部氧化和抗氧化失衡,產(chǎn)生大量活性氧自由基。過量的氧自由基可以誘發(fā)脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation，LPO) 的大量產(chǎn)生, 影響細(xì)胞內(nèi)重要生化反應(yīng)，對耳蝸組織產(chǎn)生損傷?？寡趸瘎┑氖褂每梢栽谝欢ǔ潭壬细纳泼?xì)胞的功能狀態(tài)、減輕噪聲引起的聽力損失。

α-硫辛酸是一種高效親脂的自由基清除劑，在脂質(zhì)相中有較好的溶解性，易穿過細(xì)胞膜，且毒性低，對血腦屏障有較好的穿透性，對許多自由基引起的疾病有較好的效果。它在預(yù)防及治療與自由基有關(guān)的疾病(癌癥、衰老、糖尿病、動脈粥樣硬化、腦和神經(jīng)組織的退化等)中發(fā)揮著重要的作用。實驗發(fā)現(xiàn)通過腹腔注射給予α-硫辛酸能降低噪聲引起的聽力損傷的程度[1]，但灌胃不同劑量該藥物對噪聲性聽力損傷的作用目前尚不清楚。本實驗主要研究了灌胃不同劑量的α-硫辛酸對噪聲性聽力損傷的預(yù)防和治療作用。

1 材料和方法

1.1動物和分組 24只健康雄性白色成年豚鼠，體重250～300 g左右，由上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供，耳廓反射正常，耳鏡檢查排除外耳道耵聹栓塞及中耳感染。上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)動物中心飼養(yǎng)，實驗過程中動物的處理符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)動物體重隨機(jī)分為四組：噪聲對照組(n=6，給生理鹽水)、α-硫辛酸低劑量組：n=6，30 mg/(kg·d)；α-硫辛酸中劑量組：n=6, 60 mg/(kg·d)、α-硫辛酸高劑量組：n=6, 120 mg/(kg·d)。α-硫辛酸各劑量組動物在噪聲暴露前2 d、暴露當(dāng)天至暴露后7 d連續(xù)10 d灌胃給予相應(yīng)量的α-硫辛酸；噪聲對照組動物在噪聲暴露前2 d、暴露當(dāng)天至暴露后7 d連續(xù)10 d灌胃給予等劑量的生理鹽水；各組動物飼養(yǎng)環(huán)境保持一致。實驗期間每天測定實驗動物體重以調(diào)整給藥量。

1.2藥物和制劑 α-硫辛酸(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，批號：1104008，usp)，生理鹽水(上海長征富民金山制藥有限公司)，戊巴比妥鈉 (美國Sigma， 批號：69020100)，氫氧化鈉(NaOH，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，多聚甲醛(Sigma)。α-硫辛酸配制方法：將精密稱量后的α-硫辛酸溶于適量1 mol/L的氫氧化鈉溶液中，超聲約5 min，待其完全溶解后，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4左右即得。

1.3噪聲暴露 24只豚鼠單只/籠置于混響室中心位置，持續(xù)暴露于115 dBA(混響室四角與中心強(qiáng)度差異≤1 dBA)窄帶噪聲(中心頻率4 kHz，帶寬1 kHz)，暴露時間4 h。

噪聲發(fā)生過程：信號經(jīng)BK1207信號發(fā)生器產(chǎn)生，經(jīng)Feile-FJD系列功率放大器放大，經(jīng)Dbx-223電子分頻器進(jìn)行高低頻信號的頻率分離，由Feile系列高低頻喇叭放聲。

噪聲監(jiān)測：用BK2230精密聲級計對混響室噪聲進(jìn)行強(qiáng)度測量與頻譜分析。

1.4指標(biāo)測試方法 單頻腦干聽覺誘發(fā)電位(auditory brainstem response，ABR)測試：各組豚鼠分別在噪聲暴露前1 d進(jìn)行第1次ABR閾值測定，強(qiáng)噪聲暴露后1 d進(jìn)行第2次ABR閾值測定，強(qiáng)噪聲暴露后7 d進(jìn)行第3次ABR閾值測定，強(qiáng)噪聲暴露后10 d進(jìn)行第四次ABR閾值測定。

單頻ABR測試在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，測試儀器為美國TDT system 3電反應(yīng)測聽系統(tǒng)(TUCKER．DAVIS)。豚鼠用戊巴比妥鈉(35 mg/kg, ip)麻醉后，固定于墊有軟布的桌上。測試時，安放皮下針形電極，記錄電極置于給聲側(cè)的耳后乳突，參考電極置于顱頂兩耳中線處，接地電極置于鼻根。內(nèi)置揚(yáng)聲器置于豚鼠耳道內(nèi)約1 cm位置處。記錄ABR的參數(shù)設(shè)置：刺激聲:純音8、16、24、32 kHz；掃描時間窗:10.24 ms；刺激聲重復(fù)率:21.1次/s；平均疊加次數(shù)為500次；濾波帶寬：0.1～3 kHz；極性：疏、密波交替；強(qiáng)度：根據(jù)各組預(yù)估的閾值選定起始強(qiáng)度(一般為90 dB SPL)，依次降低5 dB SPL至閾值出現(xiàn)，重復(fù)2次；極間阻抗：<3 kΩ。閾值判定主要依據(jù)聽覺誘發(fā)電位圖中較明顯且穩(wěn)定的II、Ⅲ波變化，該波消失前的最低強(qiáng)度判定為該豚鼠該耳的聽力閾值,閾值小于20 dB SPL記為20 dB SPL,大于100 dB SPL記為100 dB SPL。

1.5組織學(xué)標(biāo)本制備 動物在最后一次ABR測試后，麻醉狀態(tài)下快速斷頭，取出雙側(cè)顳骨，挑破圓窗膜，打開卵圓窗，用針在蝸尖挑一小孔，用2.5%戊二醛做蝸管內(nèi)灌注固定，置冰箱內(nèi)連續(xù)8 h，隨后去除耳蝸骨殼、螺旋韌帶、前庭膜，充分暴露Corti(柯蒂)器。0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗后，1%四氧化鋨固定2 h，單寧酸導(dǎo)電染色，梯度酒精脫水，HCP-2型臨界點干燥儀干燥，E-102型離子濺射儀鍍金，Hitachi S-800掃描電鏡觀察內(nèi)外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 實驗所得資料采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，對各組數(shù)據(jù)按完全隨機(jī)設(shè)計多個樣本均數(shù)比較的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計比較。

2 結(jié)果

2.1不同頻率刺激聲時豚鼠聽力閾移 各實驗組動物在不同頻率刺激聲時，噪聲暴露后不同時間的聽閾偏移值見表1。實驗數(shù)據(jù)行完全隨機(jī)設(shè)計多樣本均數(shù)比較的方差分析。結(jié)果表明，噪聲對照組和α-硫辛酸組均有明顯聽力損傷，表現(xiàn)為聽閾上移。

表1 不同頻率對豚鼠聽覺腦干誘發(fā)電位(ABR)閾移值

1)P<0.05,2)P<0.01,與噪聲對照組比較。

噪聲暴露結(jié)束后3 d，檢查指標(biāo)主要反映藥物對于噪聲損傷的預(yù)防作用。8、16 kHz刺激聲時，低、中、高劑量組與噪聲對照組相比均有顯著性差異；24、32 kHz的低、高劑量組與噪聲對照組相比有顯著性差異。表明低、高劑量的α-硫辛酸對各頻率的聽力損傷具有良好的預(yù)防作用。

噪聲暴露結(jié)束后7 d，檢查指標(biāo)主要反映藥物對于噪聲損傷暫時性聽閾偏移的治療作用。8、16、24 kHz刺激聲時，中、高劑量組與噪聲對照組相比均有顯著性差異； 32 kHz刺激聲時，低、高劑量組與噪聲對照組相比有顯著性差異。表明中、高劑量的α-硫辛酸對各頻率聽力損傷的暫時性聽閾偏移具有良好的治療作用。

噪聲暴露結(jié)束后10 d，檢查指標(biāo)主要反映藥物對于噪聲損傷永久性聽閾偏移的治療作用。8、16、24、32 kHz純音刺激時，高劑量組與噪聲對照組比較有顯著性差異。表明高劑量的α-硫辛酸對噪聲所致聽力損傷具有良好的治療作用。

暴露前后給予120 mg/kg的α-硫辛酸既能起到預(yù)防作用又能達(dá)到治療效果；暴露前給予30 mg/kg的α-硫辛酸即可起到預(yù)防作用。

2.2組織學(xué)檢查 耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞在5000倍和2 000倍放大倍數(shù)下觀察發(fā)現(xiàn)：對照組動物耳蝸外毛細(xì)胞在噪聲暴露后有明顯的倒伏、水腫、空泡變性，個別細(xì)胞死亡(見圖1)；低、中劑量組毛細(xì)胞有一定的倒伏現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)水腫、空泡變性等(見圖2、圖3)；高劑量組實驗動物毛細(xì)胞排列整齊，無明顯缺失，形態(tài)正常(見圖4)。

圖1 噪聲對照組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞掃描電鏡圖片(5 000x、2 000x)

圖2 α-硫辛酸低劑量組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞掃描電鏡圖片(5 000x、2 000x)

圖3 α-硫辛酸中劑量組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞掃描電鏡圖片(5 000x、2 000x)

圖4 α-硫辛酸高劑量組豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞掃描電鏡圖片(5 000x、2 000x)

3 討 論

關(guān)于噪聲性聽力損傷的發(fā)生機(jī)制說法眾多，過量氧自由基的產(chǎn)生是公認(rèn)的重要病因之一。氧自由基是指含有一個或多個不成對電子的基團(tuán)，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、活性氮(reactive nitrogen species，RNS)等。噪聲暴露可破壞耳蝸的抗氧化體系，導(dǎo)致氧化-抗氧化失衡，在耳蝸產(chǎn)生大量活性氧自由基，過量的氧自由基會損壞細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白、DNA等的結(jié)構(gòu)，對耳蝸組織產(chǎn)生損傷[2]。Colleen等[3]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露1～2 h，耳蝸內(nèi)羥基數(shù)量增加近4倍，而DNA對羥基敏感,很容易受到羥基損傷。耳蝸細(xì)胞會在噪聲暴露后7～10 d連續(xù)產(chǎn)生大量氧自由基，證實活性氧自由基的產(chǎn)生是引起耳蝸損傷的重要原因。更為嚴(yán)重的是，過量氧自由基還會向下發(fā)展，引起內(nèi)耳血管發(fā)生一系列改變：血管痙攣收縮、血流速度變慢、局部血液灌注量減少、血管內(nèi)皮腫脹、通透性增加、血液濃縮導(dǎo)致粘滯度顯著增高、血小板和紅細(xì)胞聚集、血栓形成等，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，形成永久性閾移。

α-硫辛酸是一種超強(qiáng)的抗氧化劑，是機(jī)體細(xì)胞利用糖類等能源物質(zhì)產(chǎn)生能量所需的一種限制性必需營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛用于預(yù)防和治療心臟病、糖尿病等多種疾病。一般認(rèn)為它能保存和再生其它抗氧化劑，如維生素C和維生素E等，并能平衡血糖濃度，可有效強(qiáng)化體內(nèi)免疫系統(tǒng)，使之免受氧自由基的破壞。α-硫辛酸能預(yù)防因噪聲引起的豚鼠血清總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)下降，限制耳蝸中一氧化氮(nitric oxide，NO)的大量產(chǎn)生，對噪聲性聽力損傷具有一定的保護(hù)作用[4]。這種保護(hù)作用可能與減少氧自由基水平和限制NO含量有關(guān)。在噪聲狀態(tài)下，耳蝸生成大量NO及ROS，NO和ROS對耳蝸產(chǎn)生毒性作用。α-硫辛酸不僅可以清除次氯酸、NO、氧、過氧化氫，還具有很強(qiáng)的鐵離子鰲合的能力。α-硫辛酸的鐵離子螯合能力也可能是它抗氧化效果的一個重要因素。

Subramaniam等[5]對噪聲暴露后第1天至第15天的聽力情況進(jìn)行了細(xì)致研究，結(jié)果表明：動物暴露于穩(wěn)態(tài)噪聲4 h,聽力閾值在暴露第7天后基本恢復(fù)至噪聲暴露前水平,說明聽閾提高為暫時性閾移；暴露后的第3天，動物聽力處于損傷急性期，聽力閾值基本可以反映藥物提前干預(yù)對噪聲損傷的預(yù)防作用；噪聲暴露10 d以后，動物聽力的自我恢復(fù)能力對聽力影響較小，基本可以反映藥物對永久性聽閾偏移的治療作用。因此，我們的試驗通過采集噪聲暴露后第3天、第7天、第10 天的數(shù)據(jù)，分別考察藥物的預(yù)防作用、對暫時性聽閾偏移的治療作用、對永久性聽閾偏移的治療作用。我們的實驗結(jié)果表明，與噪聲對照組相比，噪聲暴露前灌胃低劑量α-硫辛酸(30 mg/ kg·d)對噪聲引起的豚鼠聽力損傷有很好的預(yù)防作用；噪聲暴露前后，灌胃高劑量α-硫辛酸(120 mg/kg·d)不僅具有很好的預(yù)防作用，而且具有很明顯的治療作用，可減輕急性期暫時性聽力損失的程度，也能促進(jìn)閾移的恢復(fù)，預(yù)防永久性聽力損失。組織形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果也印證了這一點。噪聲暴露前后灌胃中劑量的α-硫辛酸也可起到一定的防治作用，但是效果不明顯。本實驗的不足之處主要是：①考察的噪聲頻率略少。我們的實驗考查了實驗動物在8、16、24、32 kHz純音刺激下的聽力情況，受制于實驗條件，未能對1、2、4 kHz的純刺激音的情況進(jìn)行研究。②形態(tài)學(xué)觀察比較粗略。我們通過耳蝸掃描電鏡觀察豚鼠耳蝸毛細(xì)胞的損傷情況，未對其內(nèi)部形態(tài)變化做更加細(xì)致的研究。

以α-硫辛酸為代表的抗氧化劑在噪聲性聽力損傷防治方面的研究較多，效果比較確切。但是此類藥物具有一定的局限性：①普遍用量較大。Wu等[6]研究表明腹腔注射325 mg/(kg·d)體重的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，暴露前2 d開始給藥，連續(xù)14 d，可有效保護(hù)單純噪聲性聽力損傷。本實驗中各劑量的α-硫辛酸的效果比較也體現(xiàn)了一定的劑量依賴性。②大多為注射給藥或鼓室給藥，使用不方便。③大多作用于單一環(huán)節(jié)，效果有待提高。噪聲性聽力損傷的多發(fā)機(jī)制決定了單一用藥在防治方面的不足和局限。藥物聯(lián)合應(yīng)用則可以降低藥物用量、減小副作用[7]。因此，針對單一用藥的局限性，開發(fā)一種療效確切、安全度高、使用方便的復(fù)方藥物成為一種趨勢和方向。

[1] Seidman MD, Khan MJ, Bai U,etal. Biologic activity of mitochondrial metabolites on aging and age-related hearing loss[J]. Am J Otol, 2000, 21:161.

[2] 鄭貴亮，翟所強(qiáng).噪聲性耳聾的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2008,48(15)：115.

[3] Le Prell CG, Yamashita D, Minamic SB,etal. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention[J]. Hear Res, 2007, 226:22.

[4] 刁明芳，劉海瑛，張琰敏，等.噪聲刺激后豚鼠耳蝸抗氧化能力的變化和α-硫辛酸對聲損傷的保護(hù)作用[J].生理學(xué)報，2003,55(6)：672.

[5] Subramaniam M, Salvi RJ, Spongr VP,etal. Changes in distortion product otoacoustic emissions and outer hair cells following interrupted noise exposures[J].Hear Res,1994,74:204.

[6] Wu HP，Hsu CJ，Cheng TJ,etal.N-acetylcysteine attenuates noise-induced permanent hearing loss in diabetic rats[J]. Hear Res, 2010, 267: 71.

[7] Coleman JKM, Kopke RD, Liu J,etal.Pharmacological rescue of noise induced hearing loss using N-acetylcysteine and acetyl-L-carnitine[J]. Hear Res,2007,226: 104.

Protectiveeffectofα-lipoicacidonnoiseinducedhearinglossinguineapigs

WANG Xi-ying1, ZHU Quan-gang1,GAO Jing2,GAO Shen1,PAN Yong-hua1, MIAO Peng3
(1.Department of Pharmacy, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;2.School of pharmacy，Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;3.Bengbu Medical College，Bengbu 233030,China)

ObjectiveTo observe the protection of free radical scavenger: α-lipoic acid on the explosive hearing loss in rats.Methods24 pure white male guinea pigs weighted between 250～300 g, which were randomly divided into α-lipoic acid low, medium, high group(n=3×6), Noise controlled group(n=6). Each group of animals was exposed to octave band noise (4 kHz center frequency) 115 dB SPL 4 h. α-Lipoic acid group were administered α-lipoic acid 30 mg/(kg·d), 60 mg/(kg·d), 120 mg/(kg·d) for 10 days (2 days before the exposure, 7 days after); Noise controlled group animals were given normal saline orally. After exposure, auditory brainstem response (ABRs) was tested in animals in each group at different times; hair cell loss and damage were examined through histological means.ResultsAfter exposure of 3 days, lower/middle/ high dose group had significant differences with noise control group at frequencies 8, 16 kHz; low and high dose group had significant differences with noise control group at frequencies 24, 32 kHz; 7 days after exposure, middle/ high dose group had significant differences with noise control group at frequencies of 8, 16, 24 kHz), low and high dose group had significant differences with noise control group at frequencies 32 kHz; after 10 days, high dose group had significant differences with noise control group at each frequencies . In the histological examination, animals of three α-lipoic acid dose group were found little inside and outside hair cell loss or damage. Noise controlled animals showed outer hair cells in the ear edema/vacuolar degeneration and other diseases.ConclusionsLow, middle, high doses of a-lipoic acid on the explosive hearing loss had a preventive effect. High dose α-lipoic acid could take a good prevention and treatment in noise-induced hearing loss.

noise induced hearing loss; auditory brainstem response; α-lipoic acid; protective effect; preventive effect

R965

A

1006-0111(2012)02-0103-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.02.007

2011-11-24

[修回日期]2012-01-11