許銘炎， 鄧小玲， 陳錫和， 楊利和， 姚小武， 傅玉才

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1第二附屬醫(yī)院口腔科，2細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，3細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

1000-4718(2012)03-0488-04

2011-10-22

2011-12-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81072208)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2011010005106)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No.A2010407)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與臨床科研基金資助項(xiàng)目

△通訊作者 Tel: 0754-88900497; E-mail: caseydxl@yahoo.com

溶血磷脂酸對上皮細(xì)胞整合素β6表達(dá)的影響*

許銘炎1， 鄧小玲2△， 陳錫和3， 楊利和1， 姚小武1， 傅玉才3

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院1第二附屬醫(yī)院口腔科，2細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，3細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

目的探討溶血磷脂酸(LPA)在體外對整合素β6(ITGB6)表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究LPA誘導(dǎo)的活化轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)在此過程中的作用。方法原代培養(yǎng)的正常人支氣管上皮(NHBE)細(xì)胞接種于6孔板中，經(jīng)LPA誘導(dǎo)，收集細(xì)胞，分別利用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測ITGB6 mRNA及細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)；利用轉(zhuǎn)染有TGF-β應(yīng)答性纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)啟動(dòng)子片段并融合螢火蟲熒光報(bào)告基因片段的轉(zhuǎn)化貂肺上皮細(xì)胞(TMLC)作為TGF-β活性報(bào)告細(xì)胞檢測活化的TGF-β。結(jié)果(1) 10 μmol/L LPA誘導(dǎo)2 h后，ITGB6 mRNA在上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，具有明顯的時(shí)間依賴性。(2) 10 μmol/L LPA誘導(dǎo)4 h后，上皮細(xì)胞表面ITGB6蛋白表達(dá)明顯增加。(3) 抗αVβ6抗體可阻斷LPA誘導(dǎo)的活化TGF-β，但不能阻斷LPA誘導(dǎo)的ITGB6 mRNA的表達(dá)。結(jié)論(1) LPA可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞ITGB6 mRNA和細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)。(2) LPA誘導(dǎo)的ITGB6 mRNA 表達(dá)不依賴LPA 誘導(dǎo)的TGF-β活化。

溶血磷脂酸； 整合素β6； 上皮細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β

整合素αVβ6是由αV亞單位和β6亞單位組成的跨膜異二聚體，是一種只特異性在上皮組織中表達(dá)的特殊亞型整合素[1]。它在正常上皮組織中幾乎沒表達(dá)，但在創(chuàng)傷愈合、炎癥反應(yīng)及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移時(shí)表達(dá)上調(diào)，參與上皮組織的重建修復(fù)及上皮組織源性惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-6]，但影響其表達(dá)的具體因素并未完全闡明。雖然有報(bào)道轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)可上調(diào)整合素αVβ6的表達(dá)[7]，但上皮重建及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中需要多種生物活性物質(zhì)參與，有必要進(jìn)一步探討影響αVβ6表達(dá)的其它因素。由于整合素β6亞單位(integrin β6, ITGB6)只能與αV亞單位形成，因此,ITGB6是αVβ6的關(guān)鍵性亞單位，可通過研究ITGB6的表達(dá)體現(xiàn)整個(gè)異二聚體αVβ6的表達(dá)狀態(tài)。

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA) 是一種具有類生長因子活性的磷脂分子，存在于血漿、血清、唾液等多種體液中，促進(jìn)細(xì)胞增殖、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞骨架改變以及腫瘤細(xì)胞移動(dòng)和侵襲等[8]，參與上皮創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種疾病的病理生理過程[9]。我們前期報(bào)道了LPA可誘導(dǎo)整合素αVβ6介導(dǎo)TGF-β的活化，參與組織纖維化進(jìn)程[10]，但尚不清楚LPA是否可影響整合素αVβ6的表達(dá)，同時(shí)也不清楚整合素αVβ6的表達(dá)是否與LPA誘導(dǎo)的TGF-β活化存在相互作用。因此，本文以表達(dá)有整合素αVβ6的支氣管上皮細(xì)胞NHBE為研究對象，探討LPA對上皮細(xì)胞ITGB6表達(dá)的影響及其與TGF-β活化的關(guān)系，進(jìn)而解析LPA對整合素αVβ6表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞株和試劑

正常人支氣管上皮(normal human bronchial epithelial,NHBE)細(xì)胞株及培養(yǎng)基購自Lonza。轉(zhuǎn)化貂肺上皮細(xì)胞(transformed mink lung epithelial cells,TMLC)由Dr.Rifkin 惠贈(zèng)。LPA購自Sigma。抗整合素αVβ6單克隆抗體10D5和PE標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白IgG均購自Chemicon。抗TGF-β的抗體1D11購自R&D?？俁NA提取試劑盒購自北京東盛生物公司。cDNA合成及PCR反應(yīng)試劑盒購自北京TransGen Biotech。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) NHBE細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，用KSF完全培養(yǎng)劑(含1.5 mg/L BSA、50 nmol/L EGF, 100 mg/L 青、鏈霉素)，于37 ℃、50% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3代以內(nèi)的NHBE細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板各孔內(nèi)，用2 mL 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后換無輔助培養(yǎng)劑的KSF培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)，對照組內(nèi)加入無輔助培養(yǎng)劑的KSF培養(yǎng)液，其它組每孔細(xì)胞內(nèi)加入LPA(10 μmol/L)，分別培養(yǎng)0、15 min、1 h、2 h、4 h和6 h后收取細(xì)胞用于檢測ITGB6 mRNA水平。

2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測ITGB6 mRNA表達(dá) 應(yīng)用通用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，1 μg總RNA經(jīng) EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA， 取1μL cDNA利用ITGB6引物及GAPDH 引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)( 2 × EasyTaq PCR SuperMix 試劑盒)，反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；接著95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)；最終將PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Photoshop軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。 ITGB6的上游引物5’-TCTGGAGTTGGCGAAAGG-3’，下游引物 5’-TCCACCGGGTAGTCCTCA-3’，產(chǎn)物片段245 bp。 GAPDH的上游引物5’- CAATGACCCCTTCATTGACCTC -3’，下游引物5’- CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3’，產(chǎn)物片段143 bp。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面ITGB6蛋白的表達(dá) 用胰蛋白酶(trypsin)/EDTA收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞，用羊血清在4 ℃下封閉20 min，1 000 r/min 離心沉淀細(xì)胞，用含有鈣離子和鎂離子的PBS漂洗1次，1 000 r/min 離心棄上清，在抗αVβ6的單克隆抗體10D5(10 g/L)中4 ℃下孵化20 min，接著用含有鈣離子和鎂離子的PBS漂洗2次，以標(biāo)記藻紅蛋白的Ⅱ抗羊抗鼠IgG(1∶200) 4 ℃染色20 min，然后再用PBS漂洗2次，取0.5 mL PBS重懸液在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。

2.4TGF-β活性的檢測 利用轉(zhuǎn)染有TGF-β應(yīng)答性纖溶酶原激活抑制劑1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)啟動(dòng)子片段并融合螢火蟲熒光報(bào)告基因片段的TMLC作為TGF-β活性報(bào)告細(xì)胞檢測活化的TGF-β。TMLC在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長16 h后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)2 h，利用胰酶消化收集細(xì)胞，用無血清的DMEM重懸為5×108cells/L，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入抗αVβ6抗體(5 g/L)或TGF-β抗體(10 g/L)，取100 μL/well TMLC懸液加入已接種NHBE細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)加入100 μL不同濃度的LPA進(jìn)入共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)過夜后，吸棄上清，用PBS漂洗1次，加入報(bào)告基因系統(tǒng)細(xì)胞裂解液(Promega,北京)，充分振蕩裂解，1 500×g4 ℃離心5 min，收集上清，加入熒光素酶分析緩沖液，用熒光發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1LPA誘導(dǎo)上皮細(xì)胞ITGB6mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性

RT-PCR結(jié)果顯示，LPA作用2 h后即可誘導(dǎo)ITGB6 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，隨著作用時(shí)間延長，ITGB6 mRNA的表達(dá)量顯著增加，具有明顯的時(shí)間依賴性，見圖1。

圖1LPA誘導(dǎo)上皮細(xì)胞ITGB6mRNA表達(dá)

2LPA誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表面ITGB6蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，NHBE 細(xì)胞表面可檢測到ITGB6的表達(dá)峰，經(jīng)LPA誘導(dǎo)4 h后，ITGB6表達(dá)峰明顯右移，見圖2，提示細(xì)胞表面的ITGB6表達(dá)增加。

3LPA上調(diào)ITGB6表達(dá)不依賴活化的TGF-β

結(jié)果顯示,LPA可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞TGF-β的活化，且呈劑量依賴性，所誘導(dǎo)的活化TGF-β可被抗αVβ6抗體及抗TGF-β抗體阻斷，見圖3A；但RT-PCR結(jié)果顯示抗αVβ6抗體不能阻斷LPA誘導(dǎo)的ITGB6表達(dá)，提示LPA上調(diào)ITGB6的表達(dá)不依賴活化TGF-β的生成，見圖3B。

討 論

整合素αVβ6是一種重要的細(xì)胞黏附分子，探討影響其表達(dá)的相關(guān)因素，有利于正確解釋αVβ6在上皮炎癥應(yīng)答、重建修復(fù)及上皮源性惡性腫瘤中過度表達(dá)的分子機(jī)制，也為組織特異性下調(diào)整合素αVβ6表達(dá)提供新思路，并為尋找新的有效干預(yù)靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

Figure 2. The expression of ITGB6 on epithelial cell surfaces was detected by flow cytometry.

圖2上皮細(xì)胞表面ITGB6的表達(dá)

LPA作為一種重要的細(xì)胞外信號遞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)第二信使。在正常生理狀態(tài)下，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、影響細(xì)胞形態(tài)、加速傷口愈合等生理功能[11]；近年來研究發(fā)現(xiàn)LPA與腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性化程度密切相關(guān)[12]；這些生物作用與整合素αVβ6有重疊。本研究通過RT-PCR及流式細(xì)胞檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LPA可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞ITGB6 mRNA和細(xì)胞表面蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性，提示LPA的生物作用可能部分通過整合素αVβ6起作用，這可能是兩者間生物功能重疊的原因之一。

我們的前期研究報(bào)道了LPA可誘導(dǎo)TGF-β的活化[10]，而TGF-β能上調(diào)ITGB6的表達(dá)，但我們通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LPA誘導(dǎo)ITGB6表達(dá)不依賴于活化的TGF-β,也就是說，LPA對ITGB6表達(dá)的影響不需要通過活化的TGF-β，這提示LPA可能直接作用于ITGB6表達(dá)的調(diào)控元件，影響ITGB6的轉(zhuǎn)錄和翻譯；另一方面提示LPA上調(diào)ITGB6表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能不同于LPA誘導(dǎo)TGF-β活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，確切機(jī)制需要在以后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)LPA是一種新的ITGB6表達(dá)誘導(dǎo)劑，這為ITGB6表達(dá)調(diào)控的研究提供另一誘導(dǎo)工具，也為αVβ6表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，我們的結(jié)果提示LPA可能通過新的基因表達(dá)調(diào)控通路及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子影響整合素αVβ6的表達(dá)，這將進(jìn)一步豐富基因調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路理論。

圖3LPA上調(diào)ITGB6表達(dá)不依賴活化的TGF-β

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Effectoflysophosphatidicacidonexpressionofintegrinβ6inepithelialcells

XU Ming-yan1, DENG Xiao-ling2, CHEN Xi-he3, YANG Li-he1, YAO Xiao-wu1, FU Yu-cai3

(1DepartmentofStomatology,TheSecondAffiliatedHospital,2DepartmentofCellBiologyandGenetics,3LaboratoryofCellSenescence,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China.E-mail:caseydxl@yahoo.com)

AIM: To investigate the effect of lysophosphatidic acid (LPA) on the expression of integrin β6(ITGB6) for determining the role of transforming growth factor β (TGF-β) activation induced by LPA in this process.METHODSNormal human bronchial epithelial (NHBE) cells were primarily cultured in 6 well plate and stimulated with LPA. The mRNA expression of ITGB6 and the level of cell surface ITGB6 protein were detected by RT-PCR and flow cytometry,respectively. The activity of active TGF-β induced by LPA was measured by the method of transformed mink lung epithelial cells (TMLC) transfected with TGF-β responsive plasminogen activator inhibitor 1(PAI-1) promoter fused with firefly luciferase reporter gene.RESULTSAfter stimulated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 2 h, the mRNA expression of ITGB6 in epithelial cells was significantly increased in a time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that the protein level of ITGB6 on cell surface was obviously increased after treated with LPA at concentration of 10 μmol/L for 4 h. The active TGF-β induced by LPA in epithelial cells was blocked by an αVβ6blocking antibody. However, αVβ6blocking antibody failed to inhibit the mRNA expression of ITGB6 induced by LPA.CONCLUSIONLPA induces the mRNA and cell surface protein of ITGB6 in epithelial cells. The up-regulated ITGB6 expression by LPA is independent on LPA-induced TGF-β activation.

Lysophosphatidic acid; Integrin β6; Epithelial cells; Transforming growth factor beta

R735.35

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.018