張子華,吳海峰,楊鋒榮,胡 浩,李恒建,白 霞

(江蘇省吳江市中醫(yī)醫(yī)院普外科,江蘇吳江,215221)

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一,腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病死的主要原因,腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移是臨床治療失敗的主要因素。隨著對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識,發(fā)現(xiàn)有很多生物活性分子參與腫瘤的轉(zhuǎn)移與浸潤,其中主要包括乙酰肝素酶,該物質(zhì)是一種內(nèi)源性的葡萄糖酸酯酶,能夠水解細(xì)胞表面、細(xì)胞外基質(zhì)的乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的多糖側(cè)鏈,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵人基質(zhì)和血管壁[1],因此將乙酰肝素酶作為靶向治療點成為研究的熱點,國內(nèi)外關(guān)于乙酰肝素酶的研究很多,但關(guān)于其與大腸癌的相關(guān)研究報道甚少,本文采用基因干擾的方法,研究乙酰肝素酶siRNA在大腸癌中作用,為大腸癌的臨床治療,特別是在基因治療方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SW620細(xì)胞在37℃,5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。胰酶及噻唑藍(lán)(MTF),佛波酯,二甲基亞砜(DMSO),Tr-answellTM培養(yǎng)板。IGO150CO2培養(yǎng)箱,Leica熒光倒置顯微鏡。SPF級裸小鼠20只購買自南京醫(yī)科大學(xué)動物中心。Trizo總RNA提取試劑盒購自sigma公司。乙酰肝素酶siRNA購自日本 TaKaRa公司。定量實時 PCR引物購自日本Life Science公司。Hpa(H-80)兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,即用型SP-9000檢測試劑盒以及 DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染:選取對數(shù)期生長的大腸SW620癌細(xì)胞,胰酶消化法收集細(xì)胞,實驗組(n=6)使用轉(zhuǎn)染試劑將siRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)染法[2]導(dǎo)入大腸SW620癌細(xì)胞,將細(xì)胞懸浮液接種在24孔培養(yǎng)板中,21 h后待細(xì)胞融合70%左右時,用構(gòu)建的乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染到大腸SW620癌細(xì)胞,48 h后用熒光顯微檢測其轉(zhuǎn)染率。對照組的癌細(xì)胞(n=6)用非特異性的siRNA處理。

1.2.2 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率:2組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后,在熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染率。在200倍的顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野計算轉(zhuǎn)染率。

1.2.3 PCR擴(kuò)增:按照說明書,利用Trizo總RNA提取試劑盒對2組細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄成模板cDNA,以該cDNA為模板對乙酰肝素酶基因進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,75℃,30s,復(fù)性。57℃,34 s,擴(kuò)增,共40個循環(huán)。實驗數(shù)據(jù)使用7500system軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 乙酰肝素酶蛋白檢測:采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色的方法對兩組細(xì)胞進(jìn)行乙酰肝素酶蛋白的檢測[3],細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中,待細(xì)胞出現(xiàn)貼壁,吸出培養(yǎng)基,用多聚甲醛固定癌細(xì)胞15 min,用PBS浸泡3次,每次5 min。采用免疫組織化學(xué)ABC法染色,加入過氧化物酶,封閉10 min,PBS浸泡3次,再分別加入一抗和二抗,洗脫,顯色,顯微鏡下觀察顯色,加雙蒸水終止反應(yīng)。

1.2.5 細(xì)胞侵襲能力:采用24孔版凝膠侵襲小室檢測,上下室間濾膜的孔徑為10 μ m,可以模擬癌細(xì)胞的侵襲內(nèi)環(huán)境。取實驗組和對照組細(xì)胞各6 孔板 200 μL 加入上室,1000 μL 的培養(yǎng)液加入到下室,37℃,5%CO2條件下傳代培養(yǎng)48 h后,4%多聚甲醛固定,染色,顯微鏡下隨機(jī)6個視野觀察下室內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染率

分別用靶向乙酰肝素酶siRNA和非特異性的siRNA轉(zhuǎn)染實驗組和對照組,經(jīng)顯微鏡下發(fā)現(xiàn),2組的轉(zhuǎn)染率無顯著差異,見表1。

表1 2組的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率()

表1 2組的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率()

組別 n 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)(個) 轉(zhuǎn)染率(%)實驗組 6 103.5±11.3 62.8±6.3對照組 6 98.6±10.6 59.9±5.4

2.2 PCR檢測乙酰肝素酶mRNA的表達(dá)

實驗組的乙酰肝素酶mRNA的表達(dá)水平(0.3±0.1)顯著低于對照組(2.3±1.5)(P<0.01)。

2.3 免疫組化檢測乙酰肝素酶蛋白表達(dá)情況

結(jié)果顯示實驗組的乙酰肝素酶蛋白含量的表達(dá)水平(3.2±2.4)顯著低于對照組(13.1±10.4)(P<0.05)。

2.4 細(xì)胞侵襲

通過侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲力,對照組的侵襲細(xì)胞數(shù)為(125.6±10.2)個顯著多于實驗組(21.3±5.8)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

乙酰肝素酶于1975年被Ogren和Lindahl發(fā)現(xiàn),經(jīng)過幾十年的深入研究,人們對其有了全面的了解,尤其是其與腫瘤浸潤侵襲的關(guān)系引起科學(xué)工作者的廣泛的關(guān)注,很多學(xué)者已經(jīng)證實乙酰肝素酶是惡性腫瘤的重要的功能酶之一,乙酰肝素酶在卵巢癌組織的異常表達(dá)并參與卵巢癌細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管的生成[1]。乙酰肝素酶基因轉(zhuǎn)染的方法也證實乙酰肝素酶在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用,提示乙酰肝素酶可作為治療癌癥轉(zhuǎn)移的靶點。

有研究報道乙酰肝素酶在膀胱移行細(xì)胞癌組織中與膀胱移行細(xì)胞癌浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)[4],在其他惡性腫瘤中亦有表達(dá)[5-6]。但在大腸癌研究中有關(guān)乙酰肝素酶的報道甚少,本課題研究對2組大腸癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染靶向的siRNA和非特異性的siRNA,發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染率無顯著差異,推測是由于大腸癌細(xì)胞對于兩種引物無顯著的選擇性,均可部分透過細(xì)胞膜達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的,與趙玲等[1]的研究報道一致。

另外通過RT-PCR檢測乙酰肝素酶mRNA表達(dá),并利用免疫組化檢測乙酰肝素酶蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實驗組的乙酰肝素酶mRNA和蛋白含量均顯著低于對照組,說明采用RNA干擾的方法,有效地抑制了乙酰肝素酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,可能是由于siRNA能抑制乙酰肝素酶的細(xì)胞周期,逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)[7]通過對胃癌細(xì)胞的乙酰肝素酶基因進(jìn)行RNA干擾,可降低其mRNA及其蛋白含量,支持本研究結(jié)果。

本研究接著又做了侵襲實驗來檢測細(xì)胞侵襲力,結(jié)果顯示實驗組的細(xì)胞侵襲能力也顯著低于對照組,我們推測可能是由于采用靶向乙酰肝素酶的siRNA能抑制或者降低乙酰肝素酶的水解多糖側(cè)鏈功能,使其參與腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的能力下降所致,研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抑制乙酰肝素酶藥物后,腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移能力都顯著下降[8],劉玉設(shè)計構(gòu)建的雙基因shRNA基因真核表達(dá)載體,以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞,可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞乙酰肝素酶基因和蛋白的表達(dá)。降低細(xì)胞侵襲能力[9]。應(yīng)用乙酰肝素酶的反義核苷酸[10]與使用乙酰肝素酶抑制劑降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相一致[11]。

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