鄒品文， 趙春景， 李 攀， 尹小燕， 黃 紅

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科， 四川 重慶 400010；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 超聲研究所， 四川 重慶 400010；3. 四川省都江堰市疾控中心， 四川 都江堰 611830；4.四川大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 四川 成都 610041)

黃芪多糖抗S180肉瘤作用及其免疫調(diào)節(jié)的影響

鄒品文1， 趙春景1， 李 攀2， 尹小燕3， 黃 紅4

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科， 四川 重慶 400010；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 超聲研究所， 四川 重慶 400010；3. 四川省都江堰市疾控中心， 四川 都江堰 611830；4.四川大學(xué)附屬第二醫(yī)院， 四川 成都 610041)

黃芪是一味應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列上品，為補(bǔ)藥之長。其性微溫，味甘，歸肺、脾二經(jīng)，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)，是黃芪的主要活性成分之一，具有免疫促進(jìn)劑或調(diào)節(jié)劑的作用，同時(shí)具有一定的抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗應(yīng)激、抗氧化等作用。臨床上已經(jīng)用黃芪多糖治療肝炎、糖尿病、腫瘤等疾病[1-3]。本實(shí)驗(yàn)用S180肉瘤小鼠模型作為研究對象，觀察了黃芪多糖的體內(nèi)外抗S180肉瘤作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為黃芪多糖在臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器 生化培養(yǎng)箱(上海搏迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；真空抽濾泵(重慶衛(wèi)實(shí)醫(yī)療有限責(zé)任公司)；KDC-28高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.1.2 材料 藥品，環(huán)磷酰胺注射液(CTX)，江蘇恒瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20110627；藥材，黃芪，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供；動(dòng)物，健康昆明種(KM)小鼠，體重16～24 g，6～8周齡，雌雄兼用，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2007-0006；瘤株，S180瘤株由重慶醫(yī)科大學(xué)海扶腫瘤中心提供；

1.2 方法

1.2.1 黃芪多糖制備[4，5]精密稱取黃芪飲片1 000 g，加入一倍體積蒸餾水，浸泡20 h后，再加4倍體積的蒸餾水，加熱至100 ℃，40 min，濾過，將濾渣加5倍體積蒸餾水再加熱至100 ℃，40 min，過濾，合并濾液后減壓蒸餾，濃縮至100 mL左右。精制及檢測參照文獻(xiàn)[6]。得到淡黃色黃芪多糖8.6526g，純度96.7%。

1.2.2 黃芪多糖對小鼠S180肉瘤的抑制作用 取接種7 d，且腫瘤生長良好、無潰破的腹水型S180荷瘤小鼠，通過頸椎脫臼處死，然后固定在蠟板上，將腹部皮膚用2%碘酊、75%酒精消毒后，抽取腹水(乳白色的濃稠液體，置無菌容器內(nèi)塞冰袋保存，取一滴置于載玻片上，推片，經(jīng)瑞氏染色，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，瘤細(xì)胞數(shù)為97.6%)。以生理鹽水稀釋成每毫升含1×107個(gè)瘤細(xì)胞的混懸液，接種在實(shí)驗(yàn)小鼠右前肢腋窩皮下，每只接種0.2 ml上述混懸液。再將接種S180肉瘤的小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和環(huán)磷酰胺陽性對照組，標(biāo)記號并稱重。小鼠接種S180肉瘤細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組每只小鼠隔天按含黃芪多糖50 mg·kg-1、100 mg·kg-1及200 mg·kg-1劑量(劑量參考文獻(xiàn)[7])灌胃給藥；陰性對照組灌胃與實(shí)驗(yàn)組容積相等的生理鹽水；陽性對照組給予環(huán)磷酰胺注射液，每只小鼠隔天按30 μg·kg-1劑量腹腔注射1次。各組小鼠于給藥后的第12天，頸椎脫臼處死，完整剝離出瘤體，稱重，計(jì)算出抑瘤率。計(jì)算方法如下：抑瘤率=(陰性對照組瘤重-用藥組瘤重)/陰性對照組瘤重×100%。

1.2.3 黃芪多糖體外抗S180肉瘤作用 取接種7 d，且生長良好、無潰破的腹水型S180肉瘤小鼠，頸椎脫臼處死，然后固定于蠟板上，腹部皮膚用2%碘酊、75%酒精消毒后，抽取腹水。以生理鹽水稀釋成每毫升含1×106個(gè)瘤細(xì)胞的混懸液，每孔190 μl量接入96孔培養(yǎng)板，置37℃、相對濕度100%、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱里預(yù)培養(yǎng)24 h。然后取黃芪多糖，分別配制50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1的溶液，同時(shí)設(shè)置環(huán)磷酰胺陽性對照組，環(huán)磷酰胺濃度為30 μg·mL-1。每孔分別加入藥液10 μl；陰性對照組加10 μl含5%新生胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液。將各組置37℃、相對濕度100%、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔中加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振蕩，使甲臜完全溶解，轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板上，在570 nm波長處測定吸光度(OD值)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對小鼠S180肉瘤的影響 見表1，黃芪多糖劑量為50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和200 mg·kg-1時(shí)，對小鼠S180肉瘤抑瘤率分別為49.26%、61.76%和66.91%，與陰性對照組比較有顯著的抑瘤效果(P<0.01)，且在50 mg·kg-1～200 mg·kg-1范圍內(nèi)抑瘤效果與劑量呈正相關(guān)。

組 別劑量(mg·kg-1)瘤重(g)(x±s)抑瘤率(%)陰性對照/1.36±0.43黃芪多糖500.69±0.43*49.261000.52±0.39*61.762000.45±0.34*66.91環(huán)磷酰胺300.39±0.28*71.32

注：與陰性對照組比較，*P<0.01。

2.2 黃芪多糖對小鼠S180肉瘤體外增殖的影響 見表2，黃芪多糖濃度為50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1時(shí)，對S180肉瘤體外增殖有一定抑瘤作用，與陰性對照組比較有明顯的效果(P<0.01)，在50 μg·mL-1～200 μg·mL-1范圍內(nèi)抑瘤效果與濃度呈正相關(guān)。

組 別劑量(μg·mL-1)OD570(x±s)陰性對照/1.75±0.62黃芪多糖501.58±0.33*1001.33±0.25**2001.17±0.29**環(huán)磷酰胺300.69±0.18**

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

組 別劑量(mg·kg-1)CD+4CD+8CD+4/CD+8正常對照/40.37±6.5518.06±0.432.24±0.89荷瘤對照/38.92±5.7429.91±3.871.30±0.73**黃芪多糖5037.25±4.5924.06±3.101.55±0.61*10038.03±4.3321.19±1.651.79±0.51*20039.28±5.1219.27±1.732.04±0.75*環(huán)磷酰胺3039.81±2.9618.87±1.332.11±0.49*

注：用藥組與荷瘤對照組比較*P<0.05；荷瘤對照組與正常對照組比較**P<0.05。

2.4 黃芪多糖對S180小鼠外周血IL-2和IL-4水平的影響 見表4，荷瘤小鼠IL-2水平明顯下降，IL-4水平明顯升高(P<0.05)；黃芪多糖給藥11 d后，各用藥組的IL-2水平顯著升高，IL-4水平顯著降低，用藥組與荷瘤對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。

組 別劑量(mg·kg-1)IL-2IL-4正常對照/146.31±25.1797.98±8.36荷瘤對照/98.65±19.09**126.33±12.11**黃芪多糖50108.77±14.62*118.19±16.26*100121.68±16.37*105.24±15.59*200139.42±20.53*99.49±12.75*環(huán)磷酰胺30130.37±18.80*103.18±13.62*

注：用藥組與荷瘤對照組比較*P<0.05；荷瘤對照組與正常對照組比較**P<0.05。

3 討論

黃芪多糖的收率與純度與提取次數(shù)及醇的濃度有關(guān)。提取的次數(shù)越多，多糖的含量略有提高，但得率有所下降。醇提取液濃度越高，多糖的得率就越高，但含量會(huì)下降[4,5,8]。綜合成本與收率，在提取與精制過程中，應(yīng)注意選擇合適的提取次數(shù)與醇濃度。本實(shí)驗(yàn)采用5倍體積水重復(fù)提取一次，濃縮后，90% 乙醇提純精制。

白細(xì)胞介素IL-2和白細(xì)胞介素IL-4作用于免疫反應(yīng)的不同階段，可以協(xié)同增強(qiáng)抗腫瘤作用。經(jīng)典抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺對IL-2的影響相對較弱，對IL-4有一定的影響。表4結(jié)果表明，黃芪多糖能顯著改善荷瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素IL-2和白細(xì)胞介素IL-4的水平。提示本研究可能是通過提高荷瘤小鼠自身的免疫能力達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

傳統(tǒng)的化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也對人體的正常組織產(chǎn)生毒性，造成許多嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使病人難以耐受，造成治療失敗。黃芪多糖能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡或凋亡同時(shí)發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，改善腫瘤患者包括免疫功能在內(nèi)的機(jī)體機(jī)能狀況，從而提高惡性腫瘤患者的生存質(zhì)量和延長腫瘤患者的生存期[9]。因此，黃芪多糖在抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

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EffectsofAstragaluspolysaccharidesonAnti-S180sarcomaandimmunologicalregulation

Zoupinwen1，Zhaochunjing1，Lipan2，Yinxiaoyan3，Huanghong4

(1.Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010,China；2. Institute of Ultrasound Imaging, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010,China；3. The Disease control center of Dujiangyan, Dujiang Sichuan yan 611830,China；4.The Second Affiliated Hospital of Sichuan University, Chengdu Sichuan 610041, China)

R285.5

A

1000-2715(2012)01-0017-04

[收稿2011-08-12；修回2011-12-24]

(編輯：譚秀榮)