孫東生， 榮 蓉， 陳雷剛， 張慶波， 龔少智， 羅 麗， 王寶仁， 劉放鳴， 肖德欣， 賈長莎， 張信江

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科, 貴州 遵義 563000；2貴陽市金陽醫(yī)院 皮膚科， 貴州 貴陽 550023；3.貴州畢節(jié)地區(qū)醫(yī)院 皮膚科， 貴州 畢節(jié) 551500；4. 貴州畢節(jié)地區(qū) CDC， 貴州 畢節(jié) 551500)

麻風(fēng)患者PBMC中TLR2 mRNA表達(dá)與IL-2含量的相關(guān)性研究

孫東生1， 榮 蓉1， 陳雷剛1， 張慶波2， 龔少智1， 羅 麗1， 王寶仁3， 劉放鳴4， 肖德欣1， 賈長莎1， 張信江1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科, 貴州 遵義 563000；2貴陽市金陽醫(yī)院 皮膚科， 貴州 貴陽 550023；3.貴州畢節(jié)地區(qū)醫(yī)院 皮膚科， 貴州 畢節(jié) 551500；4. 貴州畢節(jié)地區(qū) CDC， 貴州 畢節(jié) 551500)

目的檢測麻風(fēng)患者外周血單個核(PBMC)中TLR2m RNA的表達(dá)及血清中IL-2的水平,并與正常對照組比較，探討其在麻風(fēng)發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法應(yīng)用SYBR Green熒光定量RT—PCR技術(shù)檢測TLR2mRNA在麻風(fēng)現(xiàn)癥患者PBMC中的表達(dá)以及ELISA技術(shù)檢測IL-2在血清中的水平。結(jié)果麻風(fēng)患者PBMC中，TLR2 mRNA表達(dá)水平0.56±0.06，對照組0.22±0.01；患者組明顯高于對照組(P<0.01)。IL-2 (pg/ml)23.42±16.45，對照組6.64±4.24；患者組明顯高于對照組(P<0.01)，且其兩者呈正相關(guān)(P=0.012,r=0.422)。結(jié)論麻風(fēng)患者PBMC中TLR2mRNA的表達(dá)水平與血清IL-2水平有一定相關(guān)性，TLR2與IL-2可能參與了麻風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展過程并起到一定的作用。

麻風(fēng)；Toll樣受體2； 白介素-2；外周血單一核細(xì)胞

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)在天然免疫中通過識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)而發(fā)揮作用，主要包括對外來病原微生物的識別并誘導(dǎo)非特異的前炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。麻風(fēng)是由(mycobacterium leprae,ML)感染引起的一種慢性傳染性皮膚病。TLR2是識別麻風(fēng)桿菌的主要受體，在對分枝桿菌的免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[1]。TLR2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生IL-2等諸多多種細(xì)胞因子。我們通過測定麻風(fēng)患者外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中TLR2mRNA表達(dá)和血清IL-2水平，探討兩者的關(guān)系及在麻風(fēng)免疫中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料與分組 隨機(jī)選擇貴州省畢節(jié)地區(qū)已確診登記的麻風(fēng)現(xiàn)癥病人116例, 按馬德里分類法[2]，結(jié)核樣型(TT)34例，瘤型(LL)82例；正常對照組為當(dāng)?shù)責(zé)o麻風(fēng)及其他傳染病的健康成人50例，年齡、性別與麻風(fēng)組類似。

1.2 實驗方法、試劑及儀器

1.2.1 無菌抽取患者與對照組靜脈血4 ml，置枸櫞酸鈉抗凝管混勻，用Histopaque-1077細(xì)胞分離液(美國Sigma公司)分離PBMC。采用RNAiso試劑(大連TaTkRa公司)一步法提取PBMC內(nèi)總RNA。所提取的總RNA用紫外分光光度計測A260、A280定量并檢測其純度，所有樣品比值均為1.8～2.0。取等量總RNA逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，按試劑盒說明操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85 ℃5 s。將cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀釋(10倍梯度稀釋)后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，代表各濃度的6個點基本在一條線上。

1.2.2 按RT—PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒說明操作，TLR2mRNA及β-actin引物序列。用Bio-熒光定量PCR儀檢測TLR2mRNA在PBMC中的表達(dá)。擴(kuò)增反應(yīng)條件：TLR2 PCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃5 s，退火6l ℃20 s，40個循環(huán)。β-actinPCR：預(yù)變性95 ℃10 s，1個循環(huán)；變性95 ℃5 s，退火60 ℃20 s，40個循環(huán)。PCR擴(kuò)增曲線抬頭，結(jié)合融解曲線分析如出現(xiàn)解鏈峰則認(rèn)為有擴(kuò)增，并進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。對有特異擴(kuò)增的目的基因進(jìn)行相對定量分析,目的基因的相對表達(dá)水平通過2-ΔΔct分析。

1.2.3 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-2。IL-2 ELISA試劑盒購自上海西唐生物技術(shù)有限公司。實驗操作參照試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀(thermo,type1500)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。采用秩和檢驗、pearson相關(guān)分析。P<0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 TLR2 mRNA在麻風(fēng)患者PBMC中表達(dá)見表1.TLR2 mRNA在麻風(fēng)患者PBMC中表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01);麻風(fēng)組IL-2的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01)，且其兩者呈正相關(guān)性(P=0.012,r=0.422)。

組 別例數(shù)TLR2mRNAIL-2(pg/ml)麻風(fēng)組1160.56±0.0623.42±16.45對照組500.22±0.016.64±4.24

2.2 TLR2 mRNA在TT和LL中的表達(dá)。

TLR2 mRNA和IL-2在TT組與LL組中的表達(dá)未見顯著差異P>0.05)。 (見表2)。

組 別例數(shù)TLR2mRNAIL-2(pg/ml)LL820.62±0.0722.55±16.35TT340.43±0.1125.53±16.76

3 討論

TLR2是識別分枝桿菌的主要受體，其介導(dǎo)識別革蘭陽性菌細(xì)胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸以及分支桿菌等[4，5]，TLR2通過識別分枝桿菌胞壁的組分,啟動信號傳導(dǎo)途徑,激活固有免疫細(xì)胞,導(dǎo)向抗分枝桿菌適應(yīng)性免疫[7-12]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA在麻風(fēng)患者PBMC中表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01)。這與羅麗[6]等人的研究結(jié)果一致。

TLR2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-2、IL-12等。IL-2為Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫。其在機(jī)體的免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)中起著重要的作用，在許多慢性感染性疾病中同樣發(fā)揮著重要作用。Kang[13]等在研究TLR2時發(fā)現(xiàn)帶有突變的 TLR2 的麻風(fēng)患者PBMC分泌IL-2等細(xì)胞因子的能力下降。也有研究[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)生1型麻風(fēng)反應(yīng)的患者與沒有發(fā)生1型麻風(fēng)反應(yīng)的患者相比其IL-2水平無統(tǒng)計學(xué)意義。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)患者血清中IL-2的水平明顯高于對照組(P>0.01)。并且麻風(fēng)患者PBMC中 TLR2 mRNA和IL-2的表達(dá)呈正相關(guān)性(P= 0.012,r=0.422)。這提示在麻風(fēng)桿菌作用下通過TLR2的介導(dǎo)IL-2參與了麻風(fēng)的發(fā)病過程，并在其中發(fā)揮了一定的作用。我們的研究同時發(fā)現(xiàn)，TLR2 mRNA在TT中的表達(dá)低于LL，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-2在TT中的含量高于LL,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TLR2 mRNA在TT中的表達(dá)和血清中IL-2的含量無明顯相關(guān)性,這可能與研究標(biāo)本量不多有關(guān)。

麻風(fēng)的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，通過對TLR2 mRNA和IL-2相關(guān)性的分析,有助于我們對麻風(fēng)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為麻風(fēng)的有效預(yù)防和控制提供一些理論依據(jù)。

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CorrelativestudyonexpressionofTLR2mRNAandserumlevelsofIL-2inperipheralbloodmononuclearcellsofpetientswithLeprosy

Sundongsheng，Rongrong，Chenleigang，Zhangqingbo,Gongshaozhi,Luoli,Wangbaoren，Liufangming，Xiaodexin，Jiachangsha，Zhangxinjiang

(1.Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Guizhou.Zunyi 563000,China ; 2. Department of Dermatology, Jinyang Hospital of Guiyang, Guizhou.Guiyang 550023, China; 3. Department of Dermatology, Regional Hospital of Bijie, Guizhou Bijie 551500, China; 4. Centers for Disease Control, Guizhou Bijie 551500, China)

ObjectiveTo research the expression levels of (toll-like recptor，TLR) 2 mRNA and the (interleukin-2，IL-2)in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with leprosy and the role in the occurrence and development of the leprosy.MethodsSYBR Green fluorescence quantitative RT-PCR was conducted to detect the expressions levels of TLR2mRNA and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)was conducted to detect levels of IL-2 in serum.ResultsThe levels of TLR2mRNA in the 116 cases of patients with leprosy were 0.56±0.06, that were 0.22±0.01 in the controls, the level of TLR2 mRNA in the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy were 23.42±16.45, that were 6.64±4.24 in the controls, The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。Positive correlation were found between levels of IL-2 and the levels of TLR2 mRNA in patients with leprosy(P= 0.012,r = 0.422).ConclusionThe levels of TLR2 mRNA and the levels of IL-2 were high and positive correlation. They may take part in the process of occurrence and development of the leprosy immune。

leprosy; TLR2; IL-2; PBMC

R755

A

1000-2715(2012)01-0034-03

國家自然科學(xué)基金(NO:30960350)；貴州省省長資金(NO:2006，48)。

張信江，男，研究方向：感染性皮膚病；E-mail:xinjiangzhang@sohu.com。

[收稿2011-10-09；修回2011-11-21]

(編輯：譚秀榮)