何鋒輝， 王 超， 田如平， 李 貴， 王曜暉

(1.遵義醫(yī)學院 2007級民族1班， 貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 遵義 563000)

生脈注射液對酒精性肝損傷大鼠的治療作用

何鋒輝1， 王 超1， 田如平1， 李 貴1， 王曜暉2

(1.遵義醫(yī)學院 2007級民族1班， 貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)學院 病理生理學教研室， 貴州 遵義 563000)

目的研究生脈注射液對酒精性肝損傷大鼠的治療作用。方法白酒灌胃大鼠復制酒精性肝損傷模型，采用低、高劑量的生脈注射液腹腔注射進行治療，腹主動脈采血，檢測各組血清ALT、AST水平；檢測各組肝組織勻漿SOD、MDA水平，以及肝細胞凋亡率。結(jié)果酒精灌胃3 d后血清AST增加，與對照組相比，低、高劑量生脈注射液治療組SOD增加，ALT和AST均降低，肝細胞凋亡率降低，MDA也顯著降低，形態(tài)學改變不明顯。低、高劑量生脈注射液治療組各組數(shù)據(jù)無明顯差異。結(jié)論生脈注射液對酒精性肝損傷大鼠有一定治療作用。

生脈注射液；酒精；肝損傷；大鼠

酒精性肝損傷已逐漸發(fā)展為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1],目前尚未發(fā)現(xiàn)治療酒精性肝損傷的特效藥物。生脈注射液為一種中成藥，主要由紅參、麥冬、五味子組成[2]，廣泛用于治療心絞痛[3]、、失血性休克[4]、病毒性心肌炎[5]、心肌梗塞等病征[6]。生脈注射液中紅參的有效成分為人參皂甙，具有改善循環(huán)、調(diào)整血壓和促進物質(zhì)代謝等功效[7]；麥冬的有效成分為麥冬皂甙，具有改善心肌收縮力、抗心律失常和抗菌等功效；五味子的有效成分為五味子素，具有增強肝臟解毒功能，促進肝臟蛋白質(zhì)和糖原生物合成等功效[8]。本課題擬利用生脈注射液對大鼠酒精性肝損傷進行治療，以檢測其對酒精性肝損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品與試劑 SD大鼠(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)、生脈注射液(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司10 ml×10支)、56度紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司100ml/瓶)凱基凋亡細胞形態(tài)學檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、丙二醛(Maleic Dialdehyde MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Aminotransferase ALT)試劑盒(南京建成生物工程研究所)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Aminotransferase AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物分組 40只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組10只，酒精性肝損傷組30只再隨機分為生理鹽水治療組(以下簡稱生理鹽水組)、低劑量生脈注射液治療組(以下簡稱低生脈治療組)和高劑量生脈注射液治療組(以下簡稱高生脈治療組)各10只。

2 實驗方法

2.1 動物模型的制備 酒精性肝損傷組大鼠每天禁食不禁水6 h后，按0.8 ml/100 g給大鼠灌胃紅星二鍋頭酒(56度)，1 h后重復一次，正常對照組灌服同等量生理鹽水，用法同酒精性肝損傷組，連續(xù)灌胃5 d。于第5天末次灌胃后2 h(即禁食不禁水9 h后)，各組大鼠腹主動脈采血2 ml，離心后檢測各組血清ALT，結(jié)果顯示酒精性肝損傷組ALT水平明顯高于正常組水平，說明酒精性肝損傷模型復制成功[11]。

2.2 動物給藥與取材 高生脈治療組，左下腹腹腔注射生脈注射液(1 ml/100 g)；低生脈治療組，左下腹腹腔注射生脈注射液(將生脈注射液以生理鹽水稀釋兩倍后按1ml/100g注射)；生理鹽水組，同上注射生理鹽水(1 ml/100 g)。從白酒灌胃的第3天末開始用藥至第5天，每天用藥2次，于第5天末次灌胃并注射藥2 h后(即禁食不禁水9 h后)，乙醚麻醉，腹主動脈采抗凝血2 ml后處死。于肝右葉切取0.2 cm×0.2 cm×0.5 cm肝組織1塊，部分固定于4%的多聚甲醛中(固定時間大于48 h)，用于制作石蠟切片。精確稱量200 mg肝組織，用生理鹽水4 ml制成5%的肝勻漿液，置37 ℃恒溫水浴40 min，取出流水冷卻，以3500r/min離心10min，取各組上清液供檢測肝勻漿液SOD、MDA。再取部分新鮮肝組織剪碎至1 mm3大小，然后置于100目銅網(wǎng)輕搓，邊搓邊以生理鹽水沖洗。以2 500 r/min離心5 min，棄去上清及細胞碎片，收集細胞懸液；用PBS洗滌細胞二次，并調(diào)成濃度為1×106cells/ml細胞懸液，按凱基細胞凋亡形態(tài)學檢測試劑盒說明書操作進行染色，光鏡下觀察并計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算出細胞凋亡率。采血30 min后3 000 r/min離心，分離各組血清，供檢測血清ALT、AST。

3 結(jié)果

3.1 腹主動脈采血后，檢測各組血清ALT、AST水平，結(jié)果顯示：酒精性肝損傷組ALT、AST水平明顯高于正常對照組(P<0.05)，其中高、低生脈治療組及正常對照組血清ALT、AST水平低于生理鹽水組(P<0.05)，而高生脈治療組血清ALT、AST水平略低于低生脈治療組，同理低生脈治療組低于生理鹽水組。以上各組血清ALT、AST水平存在顯著差異，說明生脈注射液對大鼠酒精性肝損傷的轉(zhuǎn)氨酶有降低作用，具有統(tǒng)計學意義(見表1)。

組 別ALTAST正常對照組18.78±6.41#21.34±9.17#生理鹽水組92.36±15.83*80.59±16.22*低生脈治療組70.58±18.46*#68.73±19.24*#高生脈治療組63.44±12.78*#65.35±21.26*#

注：*P<0.05與正常對照組比較，#P<0.05與生理鹽水組比較。

3.2 檢測各組肝組織勻漿液SOD、MDA水平，以及肝細胞凋亡率。其高、低生脈治療組SOD高于生理鹽水組，而低于正常對照組，MDA結(jié)果則剛好相反；高、低生脈治療組肝細胞凋亡率也明顯低于生理鹽水組。以上各組SOD、MDA水平存在差異性(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。說明生脈注射液對大鼠酒精性肝損傷有一定的保護作用(見表2)。

組 別SOD(Umgprot)MDA(nmol/mgprot)肝細胞凋亡率正常對照組349.06±20.39#3.57±0.26#2%生理鹽水組196.03±33.28*5.93±0.34*23%*低生脈治療組256.20±25.74*#4.82±0.41*#16%*#高生脈治療組263.10±32.56*#4.69±0.28*#18%*#

注：*P<0.05與正常對照組比較，#P<0.05與生理鹽水組比較

3.3 各組大鼠肝組織病理學檢查比較。正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰， 細胞索排列整齊， 肝細胞無明顯病變；生理鹽水組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，小葉界限不清，肝竇變窄，肝細胞出現(xiàn)散在和片狀氣球樣變，可見點狀壞死和炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)彌漫脂滴，胞核模糊不清。生理鹽水組與高、低生脈治療組無明顯差異(見圖1)。

注：A：正常對照組；B：生理鹽水組；C：低生脈治療組；D：高生脈治療組 圖1 各組肝臟組織病理切片圖(×400)

4 討論

據(jù)2003年對我國4大地區(qū)流行病學調(diào)查表明，普通人群的飲酒率為59.5%，其中男性為84.6%，女性為4%，其人均年飲酒量為3.6 L純酒精[9]。據(jù)調(diào)查2000年至2004年我國酒精性肝損傷構(gòu)成比分別為2.4%、2.7%、2.8%、3.4%、4.3%，酒精性肝損傷已逐漸發(fā)展為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。經(jīng)常過度飲酒者中有80%以上有脂肪肝，10%～35%可發(fā)展為酒精性肝炎，10%～20%可發(fā)展為肝硬化[1]。經(jīng)大量研究證實，飲酒后肝臟中乙醇脫氫酶將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛；當乙醛脫氫酶相對不足時，不能將乙醛轉(zhuǎn)化為無毒的乙酸，使肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應增強，其產(chǎn)物對肝細胞膜和線粒體膜造成損傷，導致酒精性肝損傷的發(fā)生[10]。本實驗選用大鼠為實驗對象來復制酒精性肝損傷模型，采用56度紅星二鍋頭灌胃，5 d后檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(ALT)，顯示血清ALT高于正常水平，說明模型復制成功[11]。

酒精可直接通過胃腸道黏膜吸收，進入血液循環(huán)，其中約90%在肝臟的乙醇脫氫酶等作用下轉(zhuǎn)化成為乙醛，乙醛具有很強的毒性，不僅能和蛋白質(zhì)結(jié)合引起酶的失活，影響DNA的修復，還能顯著影響肝臟對氧的利用，減少SOD的含量，促進自由基介導的組織損害及脂質(zhì)過氧化作用[11]。ALT、AST主要存在于肝細胞中，ALT主要存在于肝細胞漿中，AST主要存在于肝細胞漿之線粒體中。病理情況下自由基過多會造成肝細胞損傷，受損的肝細胞釋放ALT、AST，因此血清中的ALT、AST活性增加，所以檢測血清ALT、AST能從側(cè)面反應肝細胞是否正在受到損傷。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)：高、低生脈治療組血清ALT、AST水平均低于生理鹽水組，略高于正常對照組，而高、低生脈治療組肝勻漿液SOD高于生理鹽水組，低于正常對照組，MDA結(jié)果則剛好相反，肝細胞凋亡率也低于生理鹽水治療組，說明生脈注射液對大鼠酒精性肝損傷有一定的保護作用?？赡苤饕巧}注射液中五味子的作用，五味子的有效成分為五味子素，具有增強肝臟解毒功能，促進肝臟蛋白質(zhì)和糖原生物合成等功效；可能是由于影響了機體的氧化還原體系，減輕了自由基等對肝細胞的損傷；也可能其他成分起到一定的療效，具體的作用機制不詳。但是高、低生脈治療組的肝損傷與生理鹽水組相比較，改善并不明顯，由此也不能下結(jié)論說生脈注射液對肝臟結(jié)構(gòu)無改善作用，其可能是由于本實驗時間所限，無法觀察到此現(xiàn)象。

本實驗采用生脈注射液對酒精性肝損傷大鼠進行治療，生脈注射液在臨床上主要用來治療休克等疾病，部分臨床醫(yī)生也用其治療急性酒精中毒[12]。本實驗中結(jié)果發(fā)現(xiàn)生脈注射液對酒精性肝損傷有一定的治療作用，為酒精性肝損傷治療提供新的可能治療措施。

[1] 全國酒精性肝病調(diào)查協(xié)作組.全國酒精性肝病的多中心調(diào)查分析[J].中華消化雜志，2004，27(4):231-234.

[2]夏晶，王鋼力，季申，等.HPLC測定生脈注射液中4種成分的含量[J].中成藥，2006，28(1)：27-31.

[3]劉桂華，王文萱.黃芪、生脈注射液治療冠心病心絞痛臨床觀察[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47(16)：82-83.

[4]王開云.生脈注射液治療失血性休克 38 例[J].吉林中醫(yī)藥，2008，28(8)：576.

[5]杜麗萍，劉宏明，王學磊，等.生脈、黃芩聯(lián)合治療急性重癥病毒性心肌炎[J].中國醫(yī)藥指南，2008，6(3)：105-106.

[6]丁小飛，陳光，劉玉蘭.注射用生脈對心源性休克的影響[J].中國醫(yī)藥雜志，2007，32(21)：2299.

[7]陳燕.鮮人參生曬參和紅參的比較研究[J].海峽藥學，2006，4(18)：137.

[8]白晶，于治國.HPLC法測定生脈注射液和注射用生脈中五味子醇甲[J].中草藥，2009，40(5)：742-743.

[9]莊輝.酒精性肝病的流行病學[J].中華肝臟病雜志，2003，11(11)：689.

[10]陳彗敏，高南南.中藥抗氧化作用治療酒精性肝損傷的研究進展[J].中國中醫(yī)藥雜志，2009，24(27)：192.

[11]朱平生，龐亞麗，王宇亮，等.大鼠急性酒精性肝損傷模型的脂質(zhì)過氧化損傷觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2006，21(6)：376-377.

[12]劉振東，魏育生.生脈注射液治療急性酒精中毒60 例臨床分析[J]. 四川醫(yī)學，2000，21(5)：462.

Therapeuticeffectsofshengmaiinjectiononalcohol-inducedliverinjuryinrats

Hefenghui1，Wangchao1，Tianruping1，Ligui1，Wangyaohui2

(1. National class 1，Grade 2007，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou，563000，China；2.Pathophysiology department , Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou，563000，China)

ObjectiveTo determine the therapeutic effects of shengmai injection on the alcohol-induced liver injury in rats.MethodsRats were administered intragastrically with liquor to duplicate the alcohol-induced liver injury model and then were given intraperitoneal injection of lower and higher doses of shengmai injection. The serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase.(AST) in abdominal aorta were detected. The superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) levels in hepatic tissue and cell apoptosis were measured.ResultsCompared with the control group, AST level was increased after intragastrical administration with liquor for 3 days. Compared with the model group, the lower and higher doses of shengmai injection increased SOD contents, decreased ALT and AST levels and cell apoptosis and MDA level. However, no morphological Changes were seen. Furthermore, there was no significant difference between lower and higher doses of shengmai injection groups.ConclusionShengmai injection has therapeutic effects on alcohol-induced liver injury in rats.

Shengmai injection; alcohol; liver injury; rat

R605.97

A

1000-2715(2012)01-0021-03

遵義醫(yī)學院大學生創(chuàng)新性實驗計劃支持項目(NO：[2010]1702)。

王曜暉，男，副教授，研究方向：肥胖癥的發(fā)生機制及防治。E-mail:wangyaohui@yeah.net。

[收稿2011-09-12;修回2011-11-21]

(編輯：譚秀榮)