毛張凡， 徐小惠， 黃 杰， 耿 慶， 康敢軍

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，湖北武漢430060;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院藥劑科，湖北武漢430030)

肺癌是人類發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。盡管肺癌的治療手段日新月異，但其5年生存率經(jīng)多年研究仍無明顯改善。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)學(xué)說的提出為癌癥治療帶來了新的曙光。有研究表明干細(xì)胞中存在多種離子通道電流，如大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、大鼠胚胎干細(xì)胞和小鼠心臟干細(xì)胞中均存在不同類型的離子通道電流［1－4］。研究顯示容積激活氯通道(volume－activated chloride channel，VACC)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡并與腫瘤的多藥耐藥性密切相關(guān)［5－6］。但目前對(duì)VACC和腫瘤關(guān)系的研究均限于已分化腫瘤細(xì)胞。因此本實(shí)驗(yàn)觀察CSCs中是否存在VACC，為進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 細(xì)胞分選、培養(yǎng)及純度測(cè)定

肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(購自上海研吉生物科技有限公司)用含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代和收集均采用0．25%胰酶消化進(jìn)行。采用免疫磁珠分選(magnetic cell separation，MACS)法分離肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的CD133+和CD133－細(xì)胞，MACS體系為Miltenyi產(chǎn)品。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞108個(gè)，離心后重懸于400μL磁珠分選緩沖液中，加入100μL FcR封閉劑。制成單細(xì)胞懸液后與100μL CD133磁珠避光4℃孵育30 min。加入5 000 μL buffer，300×g離心10 min，洗滌細(xì)胞。用500μL MACS緩沖液重懸細(xì)胞。將磁分選MS柱放入磁分選器，加入500μL MACS緩沖液洗柱2次，加入細(xì)胞懸液，未與磁珠結(jié)合的CD133－細(xì)胞隨緩沖液流出。500μL MACS緩沖液沖洗吸附柱3次。將MS柱移出分離器，1 000μL磁珠分選緩沖液沖洗即獲得純化的CD133+細(xì)胞。為獲取更高純度，可將陽性分選產(chǎn)物加于另一新的分選柱，陰性細(xì)胞流出，500μL MACS緩沖液沖洗吸附柱3次，重復(fù)以上的陽性分選過程。為防止CD133+細(xì)胞分化，分選后所獲CD133+細(xì)胞用含20μg/L表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF，Peprotech)和10μg/L堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，Peprotech)的無血清RPMI－1640培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)。

流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)測(cè)定分選的CD133+細(xì)胞磁珠分選純度。1×106個(gè)細(xì)胞重懸于500μL緩沖液中，加入5μL CD133/APC熒光標(biāo)記的抗體(克隆TMP4，e－Bioscience)，4℃孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。

2 膜片鉗記錄電流

采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，應(yīng)用膜片鉗放大器(HEKA，EPC－9，German)和 PULSE軟件(HEKA，Lambrecht，German)在電壓鉗制狀態(tài)下記錄CSCs上的容積激活氯電流。吸取細(xì)胞液少許，加入1 mL細(xì)胞池內(nèi)，該細(xì)胞不易貼壁，故待細(xì)胞沉底行封接后，再以細(xì)胞外液灌流。玻璃電極(外徑1．2 mm)經(jīng)微電極拉制儀分二步拉制而成，充灌電極內(nèi)液進(jìn)入細(xì)胞外液后阻抗為2．0～3．0 MΩ。電極接觸細(xì)胞前補(bǔ)償液接電位，輕施負(fù)壓進(jìn)行封接，使封接電阻達(dá)GΩ以上。形成高阻封接后，繼續(xù)施加脈動(dòng)負(fù)壓或給予短暫電脈沖擊穿膜片形成全細(xì)胞記錄模式。補(bǔ)償瞬時(shí)和緩慢電容電流，并根據(jù)需要補(bǔ)償串聯(lián)電阻，鉗位誤差控制在小于5 mV。通過膜片鉗放大器發(fā)放刺激沖動(dòng)，激發(fā)的電流信號(hào)經(jīng)AgCl－Ag電極引導(dǎo)、放大器放大，由A/D轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，存于硬盤中以備分析。電流信號(hào)經(jīng)截止頻率2．9 kHz的四階貝塞爾低通濾波，采樣頻率5 kHz。實(shí)驗(yàn)控制在室溫22～23℃。所有細(xì)胞電流記錄均是在分選后24 h內(nèi)完成。

臺(tái)式液(mmol/L):136 NaCl，5．4 KCl，1．0 MgCl2，1．8 CaCl2，0．33 NaH2PO4，10 glucose，10 HEPES，用 NaOH 將 pH值調(diào)至7．3。低滲臺(tái)式液(0．6T，～180 mosmol/L)由臺(tái)式液中NaCl從140減至80 mmol/L制備。等滲臺(tái)式液(1T，～300 mosmol/L)由0．6T低滲臺(tái)式液中加入125 mmol/L甘露醇制備。電極內(nèi)液 (mmol/L):20 KCl，110 K －aspartate，1．0 MgCl2，10 HEPES，5 EGTA，0．1 GTP，5．0 Na2－ phosphocreatine和5．0 Mg2－ATP，用KOH 將 pH值調(diào)至7．2。氯通道阻滯劑5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid(NPPB)購自Tocris(Bristol)。其余試劑均購自Sigma。

結(jié) 果

1 免疫磁珠法分選、純化肺CD133+CSCs

用免疫磁珠法從非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中分離得到CD133+的CSCs，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度約92%，見圖1A、B。

Figure 1．The purity of CD133+and CD133－ cells．A:the purity of CD133+was 92．14%;B:the purity of CD133 － was 98．62%．圖1 CD133+和CD133－細(xì)胞純度

2 在CD133+的CSCs記錄到容積激活氯電流

膜片鉗鉗制電位－40 mV，施予－100～+70 mV、階躍10 mV、300 ms去極化脈沖。CD133+CSCs表現(xiàn)為小股內(nèi)向電流和大股伴隨著外向整流的外向電流。對(duì)鉀通道阻滯劑［5 mmol/L 4 － AP，5 mmol/L tetraethylamminonium(TEA)，0．5 mmol/L Ba2+］不敏感，說明該電流不是鉀電流;可被氯通道阻滯劑［100μmol/L 5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid(NPPB)］阻斷，說明該電流為氯電流。為研究是否為容積激活性氯通道，將細(xì)胞外液由等滲(1T)換為低滲(0．6T)后，可觀察到細(xì)胞腫脹誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜電流明顯增強(qiáng)，并可被NPPB阻斷(10 min)。NPPB被洗脫后，膜電流強(qiáng)度恢復(fù)(10 min)。

共用全細(xì)胞膜片鉗記錄40個(gè)CD133+CSCs，在其中22個(gè)細(xì)胞上記錄到容積激活氯電流，見圖2。

討 論

CSCs是腫瘤發(fā)生及復(fù)發(fā)的根源，故對(duì)CSCs的研究可能從根本上了解腫瘤，治療腫瘤。目前已從血液系統(tǒng)及乳腺、腦、前列腺、胰腺、黑色素瘤、大腸、肺的惡性腫瘤中分離得到CSCs。CD133常在各種腫瘤干細(xì)胞的研究中用于標(biāo)記CSCs。Eramo等［7］及 Tirino等［8］以 CD133 為表面標(biāo)志分離得到小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的CSCs。本實(shí)驗(yàn)用免疫磁珠法從非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中分離得到的CD133+CSCs，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度約92%。

離子通道通常在興奮組織中存在并起非常重要的生理作用，如心血管系統(tǒng)。最近的研究表明離子通道與腫瘤亦關(guān)系密切。如離子通道在非興奮性組織起源的腫瘤中高表達(dá)，而在相同起源的正常組織中低表達(dá)或不表達(dá);并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，離子通道表達(dá)類型和活性發(fā)生改變，并與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)鉀、鈉、氯、鈣通道在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段均發(fā)揮重要作用，它們通過對(duì)膜電位、細(xì)胞周期、胞內(nèi)第二信使(cAMP、cGMP、Ca2+等)濃度、胞質(zhì)pH值及細(xì)胞體積等進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡;而且參與腫瘤轉(zhuǎn)移及血管形成［9］。各類離子通道協(xié)同作用，與參與其中的信號(hào)途徑形成復(fù)雜而龐大的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控腫瘤的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)特性［10］。

Figure 2．Voltage－dependent current was recorded in a representative cell with 300 ms voltage steps between －100 and+70 mV from a holding potential of－40 mV，then back to －40 mV as shown in the inset．Voltage－dependent current was recorded during 1T(isotonic solution)，0．6T(hypotonic solution)plus100 μmol/L NPPB．The 0．6T －induced current was outwardly rectifying and significantly inhibited by NPPB at test potential．圖2 全細(xì)胞膜片鉗記錄的容積激活氯電流

目前尚無對(duì)CSCs的膜電流研究，本實(shí)驗(yàn)旨在研究CSCs中的氯通道。在氯通道與腫瘤的關(guān)系中，對(duì)VACC研究較為深入，其參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡并與腫瘤的多藥耐藥性密切相關(guān)，且以ClC－3較為重要［5］。VACC在多種腫瘤組織中高表達(dá)，其阻滯劑能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。VACC還參與腫瘤細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞在遷移過程中為了適應(yīng)新的環(huán)境，往往要發(fā)生體積形態(tài)的變化，VACC即是在這個(gè)過程中起重要作用。凋亡性容積減小(apoptotic volume decrease，AVD)是細(xì)胞凋亡早期等張性體積皺縮現(xiàn)象，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。VACC是AVD中氯離子外流的重要途徑，與腫瘤細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)密切相關(guān)，發(fā)揮重要作用［11］。由于氯離子通道既受細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，又是細(xì)胞內(nèi)外大分子交換的通路，故已有研究證實(shí)氯通道與腫瘤多藥耐藥性的關(guān)系密切［12－13］。如P－糖蛋白(P －glycoprotein，P －gp)由多藥耐藥基因編碼，是細(xì)胞膜上一種能量依賴性藥物排出泵，具有容積激活氯通道功能，P－gp能將化療藥物泵出胞外，導(dǎo)致耐藥。氯通道阻滯劑可封閉P－gp，顯著抑制藥物外排，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性［14］。CSCs對(duì)化療藥具有天然的耐受性，容積激活氯通道可能與之有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中通過全細(xì)胞膜片鉗在肺癌CD133+CSCs中記錄到容積激活氯電流。曾有學(xué)者在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及心臟干細(xì)胞中記錄到容積激活氯電流，并證明其通道蛋白類型為ClC－3［2，4］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。目前以ClC－3為靶點(diǎn)的藥物已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)階段，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果意義重大。本實(shí)驗(yàn)是首次對(duì)腫瘤干細(xì)胞電生理的研究，將為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

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