丁 勇， 程歡歡， 余榕捷， 陳建蘇

(暨南大學1附屬第一醫(yī)院眼科，2 生物工程研究所，3 醫(yī)學院眼科研究室，廣東 廣州510632)

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase－activating polypeptide，PACAP)是具有多種重要生物學功能的神經(jīng)肽，廣泛分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，主要通過作用于其特異性受體PACAP 1 型受體(PACAP type 1 receptor，PAC1－R)來實現(xiàn)神經(jīng)保護及修復的功能，這一作用已在視網(wǎng)膜上得到證實［1］。但PACAP 易被二基肽酶水解生成自身拮抗劑PACAP (6－27)或(6－38)［2］。PACAP 的N 端(His1－Ser2－Asp3－Gly4)是激活PAC1－R 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［3］。而小環(huán)肽C*HSDGIC*(CHC)由PACAP N 端5 個氨基酸經(jīng)二硫鍵環(huán)合而成，穩(wěn)定性較PACAP 更強，是PAC1－R 的新型高效激動劑［4］。

在老年性黃斑變性(age－related macular degeneration，AMD)等慢性視網(wǎng)膜疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的損傷主要表現(xiàn)為細胞凋亡［5］。內(nèi)源性色素水平增高和后極部眼底代謝活動增強使得黃斑易受光誘導的氧化應(yīng)激損傷［6］。Youn 等［7］發(fā)現(xiàn)紫外線(ultraviolet，UV)照射能引起活性氧生成進而導致氧化性應(yīng)激，誘導人RPE 細胞系A(chǔ)RPE－19 凋亡。而Mester 等［8］研究發(fā)現(xiàn)PACAP 對氧化應(yīng)激誘導的ARPE－19 凋亡具有抑制作用。本實驗旨在研究CHC 對中波紫外線(ultraviolet B，UVB)誘導的人RPE 細胞凋亡的影響，為RPE 相關(guān)病變的治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

CHC(暨南大學生物工程研究所余榕捷教授惠贈);兔源性多克隆PAC1－R 抗體(Santa Cruz);兔單克隆β－actin 抗體(Cell Signaling);山羊抗兔IgG 抗體(Santa Cruz);CCK－8 試劑盒(Donjindo);流式細胞儀(BD FACSAria TM);全波長多功能酶標儀(Tecan Safire2，Switzerland)。

2 方法

2.1 人RPE 細胞培養(yǎng) RPE 細胞來源于本實驗室存儲，第2 ～7 代用于實驗，用含10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，3 ～5 d 傳代。

2.2 CCK－8 法檢測 人RPE 細胞按5 ×103cells/well 密度于96 孔板鋪板，長至60%融合的細胞單層后加入不同濃度CHC，繼續(xù)孵育24 h。另取RPE 細胞5 ×103cells/well 種于96 孔板，孵育24 h 后，撤去培養(yǎng)基，予0.2 J/cm2UVB (波長312 nm)照射，隨后實驗組加入含不同濃度CHC 的新鮮無血清培養(yǎng)基，對照組加入正常無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK－8 溶液，培養(yǎng)2 h，用多功能酶標儀測定各孔在波長450 nm 的吸光度值(A)。實驗重復3 次。

2.3 UVB 照射 紫外燈箱(Spectronics，EBF－260C)內(nèi)進行照射，光源距樣品垂直距離15 cm 時功率為330 μW/cm2。照射時棄培養(yǎng)基，照后加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 Western blotting 檢測 收集實驗組及對照組1 ×106RPE 細胞裂解后的上清液，進行SDS－PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，PVDF 膜浸入在5%封閉液，4 ℃振蕩1 h，PVDF 膜與兔多克隆PAC1－R 抗體(1∶2 000)和兔單克隆β－actin 抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過夜，再與山羊抗兔IgG 抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，ECL 法顯色，顯影劑孵育1 min，定影劑孵育0.5 min。

2.5 流式細胞儀檢測 1 ×107/L 細胞密度種于6孔板，實驗組、對照組細胞用0.25%胰蛋白酶消化3 min，收集細胞，PBS 吹散制備成單細胞懸液，收集5 ×105個細胞，Annexin V－FITC/PI 雙染:200 μL binding buffer 加入細胞懸液中，再依次加入10 μL Annexin V－FITC、10 μL PI 輕輕混勻，JC－1 染色:加入200 μL JC－1 稀釋液輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細胞儀上檢測。

結(jié) 果

1 CCK－8 法檢測結(jié)果

圖1 顯示，100 μmol/L CHC 明顯增加人RPE 細胞活性，100 μmol/L CHC 組比對照組細胞活性增加(34.23±3.39)%，差異顯著(P ＜0.05)。除1 nmol/L組外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

Figure 1. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells determined by CCK－8 assay.±s. n=12. * P ＜0.05 vs control. CHC:C* HSDGIC* .圖1 不同濃度CHC 對人RPE 細胞活性的影響

圖2 顯示，CHC 能抑制UVB 照射誘導的人RPE細胞活性降低，100 μmol/L 組細胞活性比UVB 組增高(20.10 ±1.48)%(P ＜0.05)。除1 nmol/L 組外，10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理均能使UVB 照射后細胞活性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

Figure 2. Effects of various concentrations of CHC on the viability of human RPE cells after UVB irradiation determined by CCK－8 assay. ±s. n=12. * P ＜0.05 vs UVB.圖2 不同濃度CHC 對UVB 照射后人RPE 細胞活性的影響

2 Western blotting 檢測結(jié)果

圖3 顯示人RPE 細胞在正常狀態(tài)下表達PAC1－R，經(jīng)UVB 照射及CHC 處理后PAC1－R 表達水平發(fā)生改變。

3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

Annexin V－FITC/PI 雙染檢測發(fā)現(xiàn)對照組活細胞比例為(93.67 ±0.43)%，早期和晚期凋亡細胞占(5.69 ±0.23)%。經(jīng)0.2 J/cm2UVB 照射后凋亡細胞比例顯著增加，而100 μmol/L CHC 處理后凋亡細胞總比例下降(5.63 ±1.49)% (P ＜0.05)，見圖4。

Figure 3. Changes of PAC1 receptor (PAC1－R)protein level in human RPE cells treated with 0.2 J/cm2 UVB and in UVB and 100 μmol/L CHC co－treated RPE cells detected by Western blotting. ±s.n =3，* P ＜0.05 vs control，△P ＜0.05 vs UVB.圖3 人RPE 細胞的PAC1－R 蛋白表達

Figure 4. Proportion of living，necrotic，early，and late apoptotic cells in untreated control cells，cells exposed to 0.2 J/cm2 UVB irradiation，and cells incubated with 100 μmol/L CHC after UVB treatment. Lower left quadrant:living cells;lower right quadrant:early apoptotic cells;upper left quadrant:necrotic cells;upper right quadrant:late apoptotic cells.圖4 100 μmol/L CHC 對UVB 照射后RPE 細胞中凋亡細胞比例的影響

4 流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位

JC－1 檢測發(fā)現(xiàn)UVB 照射組低線粒體膜電位細胞比例顯著增加，而CHC 處理后線粒體去極化細胞比例下降(5.2 ±0.5)% (P ＜0.05)，表明線粒體途徑可能參與UVB 誘導的RPE 細胞凋亡，而CHC 能一定程度抑制線粒體膜電位降低，見圖5。

討 論

Figure 5. Effect of CHC (100 μmol/L)on mitochondral membrane potential of human RPE cells after UVB irradiation determined by flow cytometry with JC－1 staining. Lower right quadrant (Q4)indicates cells with mitochondrial depolarization.圖5 100 μmol/L CHC 對UVB 照射后RPE 細胞線粒體膜電位的影響

作為視網(wǎng)膜的最外層，RPE 在胚胎學上來自形成感覺神經(jīng)視網(wǎng)膜的神經(jīng)管。盡管RPE 不直接參與視覺的神經(jīng)發(fā)生，但對于光感受器的正常形態(tài)和功能起著關(guān)鍵作用［9］。RPE細胞的功能包括參與形成血－視網(wǎng)膜屏障，清除代謝廢物，選擇性轉(zhuǎn)運物質(zhì)至光感受器，加工維生素A，吞噬光感受器外節(jié)盤膜，促進光感受器更新等。作為AMD 重要的發(fā)病機制之一，光照損傷通過造成RPE 細胞功能障礙而最終導致AMD。大量研究已證明早期AMD(包括玻璃膜疣以及色素改變)與照射暴露之間有顯著相關(guān)性［13］。因而本實驗用紫外照射誘導凋亡，進而研究CHC 對RPE 細胞凋亡的影響，以期為AMD 的治療提供新的思路。

在視網(wǎng)膜上，PAC1－R 占PACAP 受體總量的85%，并在神經(jīng)節(jié)細胞層，內(nèi)核層和無長突神經(jīng)細胞中高表達［10］。Zhang 等［11］用PCR 技術(shù)在RPE 細胞上發(fā)現(xiàn)PAC1－R 的mRNA 表達。本實驗用Western blotting 檢測出RPE 細胞上PAC1－R 的蛋白表達。PAC1－R 通過作用于多種信號通路，如抑制線粒體凋亡通路，增加抗凋亡蛋白Bcl－2 表達和抑制caspase－3 活力來介導保護作用，其作用與上述通路開放有關(guān)，而非直接依賴于PAC1－R 表達水平［12］。PAC1－R 的高表達與組織衰老及細胞凋亡密切相關(guān)，例如PAC1－R 在老年大鼠的腦部表達水平隨著年齡增加而顯著升高，與腦部組織衰老程度成正比［15］，又有報道PAC1－R 在受到輻射及毒素損傷的胸腺中表達顯著上調(diào)［16］，這與我們觀察到的PAC1－R 在損傷的細胞中表達上調(diào)相吻合，表明PAC1－R 的表達與細胞損傷程度密切相關(guān)。UVB 照射后PAC1－R 表達代償性升高，CHC 處理后PAC1－R代償反應(yīng)減弱，表明RPE 細胞損傷程度降低。PAC1－R 激動劑能增加多種細胞的活性，例如PAC1－R被證實存在于人誘導多能干細胞(IPSCs)上，其特異激動劑能促進IPSCs 增殖［14］。有研究證明PACAP具有促進RPE 細胞活性的作用，抑制炎癥細胞因子的表達［11］，10 pmol/L ～1 μmol/L PACAP 能抑制H2O2誘導的ARPE－19 細胞凋亡［8］。本實驗在UVB 照射后用1 nmol/L ～1 mmol/L CHC 培養(yǎng)RPE細胞24 h，觀察CHC 對RPE 細胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 nmol/L ～1 mmol/L CHC 處理均能增加UVB 照射后的細胞活性，抑制凋亡，100 μmol/L CHC 作用最明顯，證明CHC 具有和PACAP 類似的抗凋亡作用。

小環(huán)肽CHC 與PACAP 相比具有以下優(yōu)勢:(1)CHC 由激活PAC1 受體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域HSDGIC 兩端添加半胱氨酸殘基(Cys)經(jīng)二硫鍵環(huán)合而成，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，不易水解，不會成為自身拮抗劑［4］;(2)CHC結(jié)構(gòu)簡單，分子量小(700 D 左右)，極易穿越血管屏障和其它組織屏障，能更好作用于視網(wǎng)膜組織，在視網(wǎng)膜保護方面具有應(yīng)用潛能。

綜上，本實驗發(fā)現(xiàn)人RPE 細胞存在PACAP 的特異受體PAC1－R 的蛋白表達，并證明由PACAP 衍生而來的小環(huán)肽C*HSDGIC*對人RPE 細胞具有促細胞活性和抗凋亡的作用。

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