張君孝， 王晨亮， 黃美近， 傅新暉， 盧碧燕， 鄧艷紅△， 劉煥亮△

(1 中山大學胃腸病學研究所，2 中山大學附屬第六醫(yī)院，廣東 廣州510655)

伊立替康(irinotecan，CPT－11)是喜樹堿半合成衍生物，在體內經羧酸酯酶(carboxylesterases，CE)水解轉化為7－乙基－10－羥基喜樹堿(7－ethyl－10－h(huán)ydroxy－camptothecin，SN－38)，SN－38 為DNA拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，作用于細胞周期S 期，抑制DNA 單鏈斷裂后的修復，干擾DNA 復制和轉錄，從而發(fā)揮細胞毒效應［1］。伊立替康是目前治療轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)最有效的化療藥物之一［2］。國外臨床研究表明采用伊立替康為基礎的化療方案可以提高患者的化療有效率、無疾病進展生存時間(progression－free survival，PFS)和總生存時間(overall survival，OS)［3－4］。

雖然伊立替康治療mCRC 的效果較好，但是由于可能發(fā)生嚴重的血液毒性和消化道毒性而應用受到限制。伊立替康的劑量依賴性毒性主要為遲發(fā)性腹瀉和中性粒細胞減少，兩者發(fā)生率分別可達到約46%和30%，甚至可以導致患者死亡［3］，其中藥物代謝的遺傳多態(tài)性是造成個體間不良反應差異的主要因素之一。伊立替康在體內的主要代謝部位為肝臟，經靜脈注射后，在體內轉化為細胞毒性更強的活性代謝產物SN－38，SN－38 經尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶家族(uridine diphosphate glucuronosyltransferases，UGTs)滅活為葡萄糖醛酸產物SN－38G 后，經膽汁排泄進入腸道，在腸道細菌β－葡萄糖醛酸酶(β－glucuronidase)作用下轉換為SN－38，引發(fā)腸黏膜損傷及遲發(fā)性腹瀉;而腸道內的UGTs 酶又可再度催化SN－38 為SN－38G 進行解毒，UGTs 酶的表達及其活性，與伊立替康的療效及不良反應密切相關［5］。

國外臨床研究表明在高加索人群應用伊立替康的患者中，UGT1A1 基因啟動子區(qū)TATA 重復序列的變化即UGT1A1*28 的雜合突變型TA6/7 和純合突變型TA7/7 顯著增加患者發(fā)生嚴重粒細胞減少和腹瀉的風險［6－7］。然而UGT1A1*28 基因多態(tài)性的分布存在著明顯的種族差異，UGT1A1*28 的純合突變型TA7/7 在亞洲人中僅為0%～5%［8－9］，遠低于在非洲人和高加索人中的頻率12% ～27% 和5% ～15%［10］。因此，UGT1A1*28 基因多態(tài)性能否作為在中國患者中的不良反應預測指標存在爭議。另外，近年的研究顯示在亞洲人群應用伊立替康進行治療的患者中UGT1A1*6(第1 外顯子211 位)雜合突變型G/A 和純合突變型A/A 顯著增加患者發(fā)生3 ～4級中性粒細胞減少、血小板減少及腹瀉的風險［11－14］。UGT1A1*6 突變在亞洲人群中的發(fā)生率高達13%～23%［10］，我們認為預測中國患者不良反應的發(fā)生應綜合考慮UGT1A1*6 和UGT1A1*28 位點基因多態(tài)性的影響。本研究通過對207 例消化道腫瘤患者的UGT1A1*6 和UGT1A1*28 基因多態(tài)性進行檢測，探討UGT1A1 基因多態(tài)性在中國人群中的分布，并對其中56 例采用含伊立替康方案化療的mCRC 患者情況進行分析，探討UGT1A1 基因多態(tài)性與伊立替康化療的不良反應和療效之間的關系。

材 料 和 方 法

1 材料

收集2010 年4 月至2012 年3 月期間在我院做基因檢測的207 例消化道腫瘤患者的外周血樣標本，進行UGT1A1*6 和UGT1A1*28 基因多態(tài)性的檢測。觀察記錄其中56 例采用含伊立替康方案化療的mCRC 患者在化療中出現不良反應的情況、腫瘤進展時間及化療療效。56 例患者中男35 例，女21例，均為漢族，年齡21 ～78 歲(中位年齡55.5 歲)?；颊呔洸±砗?或)CT 證實為mCRC，無合并嚴重心、肺、肝、腎及造血功能障礙;無黃疸及消化道梗阻;未伴發(fā)急性感染;Karnofsky Performance Status(KPS)評分90 ～100 分43 例，70 ～80 分13 例;均采用二線化療方案，其中采用FOLFIRI 方案33 例，XELIRI 方案8 例，靶向藥物+FOLFIRI 方案11 例，靶向藥物+XELIRI 方案4 例。

2 方法

2.1 UGT1A1 基因分型 化療前收集患者血液2 mL 抗凝，采用RelaxGene Blood DNA System 試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，嚴格按照說明書操作分批次統(tǒng)一提取基因組DNA，并測定濃度。PCR擴增UGT1A1 基因的目的片段，擴增引物序列為:正向引物5’－TCCCTGCTACCTTTGTGGAC－3’，反向引物5’－ATGGCACAGGGTACGTCTTC－3’;PCR 反應采用40 μL 體系包括DNA 模板10 ng(2 μL)，PCR mix 預混液(上?；巧锟萍加邢薰?20 μL，ddH2O 14 μL 及正向引物和反向引物各2 μL;反應條件為:初始變性94 ℃5 min，94 ℃30 s，64 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)，最后72 ℃7 min。電泳觀察PCR 產物是否清晰單一，符合標準后送上海英駿生物技術有限公司進行直接測序。UGT1A1*28 測序引物為:5’－ ATGGCACAGGGTACGTCTTC－3’;UGT1A1*6 測序引物為:5’－ ACCTCTGGCAGGAGCAAAG－3’。測序結果采用DNAStar 軟件顯示，人工校讀分析UGT1A1*28 和UGT1A1*6 基因型。

2.2 數據收集 在每一個化療周期，通過查閱病史、體格檢查、影像學檢查和常規(guī)實驗室檢查(包括生化檢查、血液檢查和腫瘤標志物檢查)對患者的不良反應、化療療效進行評估并記錄腫瘤進展時間(time to progression，TTP)。

2.3 藥物毒性評價標準 依據美國國立癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)提出的NCI－CTC Classification (Version 3.0)對藥物的毒性進行評價和分級。

2.4 療效評價標準 依據美國國立癌癥研究所提出的實體腫瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)進行療效評價。

2.5 研究終點和統(tǒng)計學處理 主要研究終點為腫瘤進展時間，次要研究終點為化療方案反應率、總生存時間和不良反應事件。應用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，不同基因型之間不良反應和療效的比較采用χ2檢驗或Fisher’s 精確概率法，生存分析采用Kaplan－Meier 方法，不同基因型之間腫瘤進展時間的比較采用log－rank 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 UGT1A1* 28 基因多態(tài)性分布情況

本組207 例患者中，164 例(79.2%)UGT1A1 基因啟動子區(qū)TA 序列呈6 次重復，為野生型TA6/6;41 例(19.8%)基因型為TA 序列6 次和7 次重復的雜合突變型TA6/7;2 例(1.0%)基因型為TA 序列7次重復的純合突變型TA7/7。56 例接受伊立替康化療的mCRC 患者中，47 例(83.9%)為野生型TA6/6;8 例(14.3%)為雜合突變型TA6/7;1 例(1.8%)為純合突變型TA7/7;基因型分布與總體207 例分布相似(P ＞0.05)。多態(tài)性測序結果見圖1。

2 UGT1A1* 6(第1 外顯子211 位)基因多態(tài)性分布情況

本組207 例患者中，154 例(74.4%)UGT1A1 基因第1 外顯子211 位為野生型G/G;51 例(24. 6%)UGT1A1 基因第1 外顯子211 位為雜合突變型G/A;2例(1.0%)UGT1A1 基因第1 外顯子211 位為純合突變型A/A。56 例接受伊立替康化療的mCRC 患者中，38 例(67.9%)為野生型G/G;18 例(32.1%)為雜合突變型G/A;基因型分布與總體207 例分布相似(P ＞0.05)。多態(tài)性測序結果見圖2。

Figure 1. Representative sequencing diagram of UGT1A1* 28 genotypes.A:TA6/6 wild－type genotype;B:TA 6/7 heterozygous genotype;C:TA7/7 homozygous genotype.圖1 UGT1A1* 28 3 種基因型TA6/6、TA6/7 和TA7/7 的代表性測序圖

Figure 2. Representative sequencing diagram of UGT1A1* 6 genotypes.A:G/G wild－type genotype;B:G/A heterozygous genotype;C:A/A homozygous genotype.圖2 UGT1A1* 6 3 種基因型G/G、G/A 和A/A 的代表性測序圖

3 mCRC 患者UGT1A1 基因型和藥物不良反應情況

56 例患者中，UGT1A1*28 野生型(TA6/6)47例，其中出現3 ～4 級腹瀉9 例;3 ～4 級白細胞減少8例;3 ～4 級中性粒細胞減少16 例;3 ～4 級血紅蛋白減少8 例;3 ～4 級血小板減少1 例;UGT1A1*28 突變型(TA6/7 和TA7/7)9 例，其中出現3 ～4 級腹瀉1 例;3 ～4 級白細胞減少3 例;3 ～4 級中性粒細胞減少6 例;3 ～4 級血紅蛋白減少3 例;3 ～4 級血小板減少3 例;UGT1A1*6 野生型G/G 38 例，其中出現3～4 級腹瀉3 例;3 ～4 級白細胞減少6 例;3 ～4 級中性粒細胞減少11 例;3 ～4 級血紅蛋白減少6 例;3 ～4 級血小板減少4 例;UGT1A1*6 突變型(G/A 和A/A)18 例，其中出現3 ～4 級腹瀉7 例;3 ～4 級白細胞減少5 例;3 ～4 級中性粒細胞減少11 例;3 ～4 級血紅蛋白減少5 例。統(tǒng)計分析發(fā)現，UGT1A1*28 突變型可以增加患者發(fā)生3 級以上血小板減少的風險，UGT1A1*6 突變型可以增加患者發(fā)生3 級以上腹瀉和中性粒細胞減少的風險，見表1。

4 mCRC 患者UGT1A1 基因型與療效的關系

56 例接受伊立替康化療的mCRC 患者中，療效在UGT1A1 各基因型之間的差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

表1 UGT1A1 基因型和藥物不良反應情況Table 1. Adverse drug reaction in different UGT1A1 genotypes

表2 UGT1A1 各基因型的療效情況Table 2. Response to treatment with regard to UGT1A1 genotypes

5 腫瘤進展時間與UGT1A1 基因型之間的關系

UGT1A1*28 野生型(TA6/6)和突變型(TA6/7和TA7/7)的中位腫瘤進展時間分別為8.8 個月和8.1 個月，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);UGT1A1*6野生型(G/G)和突變型(G/A 和A/A)的中位腫瘤進展時間分別為10.8 個月和8.1 個月，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見圖3。

討 論

伊立替康不良反應的發(fā)生存在明顯的個體差異，UGT1A1 是伊立替康在體內代謝的最主要代謝酶［15］，其基因多態(tài)性與伊立替康的療效和毒性有密切的關系。

本研究中207 例漢族消化道腫瘤患者的UGT1A1*28 基因多態(tài)性分布情況為野生型TA6/6，164 例 占79. 2%;雜 合 突 變 型TA6/7，41 例 占19.8%;純合突變型TA7/7，2 例占1%，與Zhang等［8］報道的對539 例和馬冬等［9］報道的對317 例中國人中UGT1A1*28 的基因多態(tài)性分布情況相一致。UGT1A1*28 雜合突變型TA6/7 和純合突變型TA7/7的頻率明顯低于在高加索人群(雜合突變型TA6/7頻率為35% ～50%，純合突變型TA7/7 頻率10% ～15%)和非洲人群(雜合突變型TA6/7 頻率為44% ～52%，純合突變型TA7/7 頻率12% ～27%)中的突變率［10］。UGT1A1*6 的基因多態(tài)性分布情況為野生型G/G，154 例占74. 4%;雜合突變型G/A，51 例占24.6%;純合突變型G/G，2 例占2.0%，與Nakamura等［16］在日本人群、Han 等［17］在韓國人群及Jada 等［14］在亞洲人群中的UGT1A1*6 基因多態(tài)性研究結果相似，但是UGT1A1*6 基因突變頻率在高加索人群和非洲人群中突變頻率非常低［10］。本研究結果提示在中國漢族人群中，UGT1A1*6 基因突變型(G/A 和A/A)的頻率為(26. 6%)高于UGT1A1*28 基因突變型(TA6/7 和TA7/7)的頻率(20.8%)，顯得更為普遍。

Figure 3. Comparison of time to progression (TTP)between UGT1A1 wild type and mutant.A:comparison of TTP between UGT1A1* 28 wild type (TA6/6)and mutant (TA6/7 and TA7/7);B:comparison of TTP between UGT1A1* 6 wild type (G/G)and mutant (G/A and A/A).圖3 UGT1A1* 28 和UGT1A1* 6 野生型和突變型之間腫瘤進展時間的比較

本研究中對56 例采用含伊立替康方案化療的mCRC 患者的不良反應和UGT1A1 基因多態(tài)性關系分析發(fā)現:UGT1A1*28 的突變型(TA6/7 和TA7/7)與野生型TA6/6 相比，可以增加患者發(fā)生3 級以上血小板減少(33.3% vs 2.1%，P ＜0.05)的風險，但不會增加患者發(fā)生3 級以上白細胞減少和中性粒細胞減少的風險;消化道毒性方面，UGT1A1*28 的突變型(TA6/7 和TA7/7)與野生型TA6/6 相比，不會增加患者發(fā)生3 級以上腹瀉的風險(11.1% vs 19.1%，P ＞0.05)。我們的研究結果與Schulz 等［18］和馬冬等［9］的研究一致，分析沒有發(fā)現UGT1A1*28 突變型(TA6/7 和TA7/7)可以增加患者發(fā)生3 級以上腹瀉的風險可能是因為UGT1A1*28 在中國人群中突變頻率太低所造成的。

UGT1A1*6 突變型(G/A 和A/A)與野生型G/G相比，可以增加患者發(fā)生3 級以上中性粒細胞減少(61.1% vs 29. 0%，P ＜0. 05)和腹瀉(38. 9% vs 7.9%，P ＜0.05)的風險，與多項在日本的臨床研究結果一致［11－14］。原因可能是因為伊立替康的活性形式為SN－38，為拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，可抑制DNA 單鏈斷裂后修復，干擾DNA 復制和轉錄，肝和腸內的代謝酶UGT1A1 可將SN－38 代謝為滅活產物SN－38G，UGT1A1*6 突變型可以使UGT1A1 的活性下降30% ～70%［19－20］，使腸道內SN－38 轉換為SN－38G 的速率下降，導致SN－38 在腸道內蓄積產生細胞毒性，直接作用于腸粘膜引起組織損傷，導致嚴重腹瀉。

本研究結果顯示UGT1A1*28 和UGT1A1*6 基因多態(tài)性和療效之間無相關性(P ＞0.05 和P ＞0.05);UGT1A1*28 野生型TA6/6 的中位TTP 為8.8月，突變型(TA6/7 和TA7/7)的中位TTP 為8.1 月，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0. 05);UGT1A1*6 野生型G/G 的中位TTP 為10.8 個月，突變型(G/A 和A/A)的中位TTP 為8.1 個月，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);我們的研究結果與Schulz 等［18］和Seo 等［21］的研究結果一致，未發(fā)現UGT1A1*6 和UGT1A1*28基因型與TTP 之間的相關性。化療療效在各基因型之間沒有差別的原因可能是因為本研究中樣本量較少和納入的患者化療方案均為二線化療方案所致，我們將進一步收集樣本，觀察病人的遠期療效，分析UGT1A1 基因多態(tài)性和伊立替康療效之間的關系，并進行機制方面的實驗研究。

綜上所述，本研究結果發(fā)現在中國漢族人群中UGT1A1*28 突變型可以增加患者發(fā)生3 級以上血小板減少的風險;UGT1A1*6 突變型可以增加患者發(fā)生3 級以上腹瀉和中性粒細胞減少的風險;UGT1A1*6突變頻率明顯高于UGT1A1*28，提示UGT1A1*6 與中國人群中伊立替康的毒性反應更為密切，因此，在臨床伊立替康毒性預測中，應綜合考慮UGT1A1*6和UGT1A1*28 基因多態(tài)性檢測，從而更好地指導臨床醫(yī)生優(yōu)化化療方案，以達到個體化醫(yī)療的目的。

［1］ Toffoli G，Cecchin E，Corona G，et al. Pharmacogenetics of irinotecan［J］. Curr Med Chem Anticancer Agents，2003，3(3):225－237.

［2］ Ulukan H，Swaan PW. Camptothecins:a review of their chemotherapeutic potential［J］. Drugs，2002，62(14):2039－2057.

［3］ Douillard JY，Cunningham D，Roth AD，et al. Irinotecan combined with fluorouracil compared with fluorouracil alone as first－line treatment for metastatic colorectal cancer:a multicentre randomised trial［J］. Lancet，2000，355(9209):1041－1047.

［4］ Saltz LB，Cox JV，Blanke C，et al. Irinotecan plus fluorouracil and leucovorin for metastatic colorectal cancer.Irinotecan Study Group［J］. N Engl J Med，2000，343(13):905－914.

［5］ Hahn KK，Wolff JJ，Kolesar JM. Pharmacogenetics and irinotecan therapy［J］. Am J Health Syst Pharm，2006，63(22):2211－2217.

［6］ Ando Y，Saka H，Ando M，et al. Polymorphisms of UDP－glucuronosyltransferase gene and irinotecan toxicity:a pharmacogenetic analysis［J］. Cancer Res，2000，60(24):6921－6926.

［7］ Martinez－Balibrea E，Abad A，Martinez－Cardus A，et al. UGT1A and TYMS genetic variants predict toxicity and response of colorectal cancer patients treated with first－line irinotecan and fluorouracil combination therapy［J］.Br J Cancer，2010，103(4):581－589.

［8］ Zhang A，Xing Q，Qin S，et al. Intra－ethnic differences in genetic variants of the UGT－glucuronosyltransferase 1A1 gene in Chinese populations［J］. Pharmacogenomics J，2007，7(5):333－338.

［9］ 馬 冬，張緒超，楊冬陽，等. 中國人UGT1A1*28 的基因多態(tài)性以及與伊立替康毒性和療效的關系［J］. 中山大學學報:醫(yī)學科學版，2011，32(4):495－499.

［10］ Kaniwa N，Kurose K，Jinno H，et al. Racial variability in haplotype frequencies of UGT1A1 and glucuronidation activity of a novel single nucleotide polymorphism 686C ＞T(P229L)found in an African－American［J］. Drug Metab Dispos，2005，33(3):458－465.

［11］ Onoue M，Terada T，Kobayashi M，et al. UGT1A1*6 polymorphism is most predictive of severe neutropenia induced by irinotecan in Japanese cancer patients［J］. Int J Clin Oncol，2009，14(2):136－142.

［12］ Takano M，Kato M，Yoshikawa T，et al. Clinical significance of UDP－glucuronosyltransferase 1A1*6 for toxicities of combination chemotherapy with irinotecan and cisplatin in gynecologic cancers:a prospective multi－institutional study［J］. Oncology，2009，76(5):315－321.

［13］ Minami H，Sai K，Saeki M，et al. Irinotecan pharmacokinetics/pharmacodynamics and UGT1A genetic polymorphisms in Japanese:roles of UGT1A1*6 and*28［J］.Pharmacogenet Genomics，2007，17(7):497－504.

［14］ Jada SR，Lim R，Wong CI，et al. Role of UGT1A1*6，UGT1A1*28 and ABCG2 c. 421C ＞A polymorphisms in irinotecan－induced neutropenia in Asian cancer patients［J］. Cancer Sci，2007，98(9):1461－1467.

［15］ Iyer L，King CD，Whitington PF，et al. Genetic predisposition to the metabolism of irinotecan (CPT－11). Role of uridine diphosphate glucuronosyltransferase isoform 1A1 in the glucuronidation of its active metabolite (SN－38)in human liver microsomes［J］. J Clin Invest，1998，101(4):847－854.

［16］ Nakamura Y，Soda H，Oka M，et al. Randomized phase II trial of irinotecan with paclitaxel or gemcitabine for non－small cell lung cancer:association of UGT1A1*6 and UGT1A1*27 with severe neutropenia［J］. J Thorac Oncol，2011，6(1):121－127.

［17］ Han JY，Lim HS，Shin ES，et al. Comprehensive analysis of UGT1A polymorphisms predictive for pharmacokinetics and treatment outcome in patients with non－small－cell lung cancer treated with irinotecan and cisplatin［J］. J Clin Oncol，2006，24(15):2237－2244.

［18］ Schulz C，Heinemann V，Schalhorn A，et al. UGT1A1 gene polymorphism:impact on toxicity and efficacy of irinotecan－based regimens in metastatic colorectal cancer［J］. World J Gastroenterol，2009，15(40):5058－5066.

［19］ Udomuksorn W，Elliot DJ，Lewis BC，et al. Influence of mutations associated with Gilbert and Crigler－Najjar type II syndromes on the glucuronidation kinetics of bilirubin and other UDP－glucuronosyltransferase 1A substrates［J］. Pharmacogenet Genomics，2007，17(12):1017－1029.

［20］ Gagne J F，Montminy V，Belanger P，et al. Common human UGT1A polymorphisms and the altered metabolism of irinotecan active metabolite 7－ethyl－10－h(huán)ydroxycamptothecin (SN－38)［J］. Mol Pharmacol，2002，62(3):608－617.

［21］ Seo BG，Kwon HC，Oh SY，et al. Comprehensive analysis of excision repair complementation group 1，glutathione S－transferase，thymidylate synthase and uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1 polymorphisms predictive for treatment outcome in patients with advanced gastric cancer treated with FOLFOX or FOLFIRI［J］. Oncol Rep，2009，22(1):127－136.