張秀英，宋 立，趙 暉，趙富華，段文龍，孫玉梅，范 強(qiáng)

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中，抗菌藥物發(fā)揮了重要的作用，但抗菌藥物長(zhǎng)期濫用和低劑量使用，使動(dòng)物源耐藥病原菌的產(chǎn)生與擴(kuò)散，造成治療失敗，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的損失。有證據(jù)表明，自允許在食品動(dòng)物中使用氟喹諾酮類抗菌藥物后，耐氟喹諾酮類菌明顯增多，出現(xiàn)了多重耐藥，耐藥性已經(jīng)成為二十一世紀(jì)人們亟待解決的難題［1-2］。在中藥抗感染治療中，細(xì)菌對(duì)抗感染中藥及其復(fù)方不易產(chǎn)生耐藥性，且部分中藥具有延緩、消除耐藥性的現(xiàn)象，增加了對(duì)抗細(xì)菌耐藥性的措施與策略［3］。本文從我國(guó)傳統(tǒng)中藥入手，以突變恢復(fù)為理論依據(jù)，選擇復(fù)方蒼術(shù)口服液和復(fù)方十大功勞顆粒作用恩諾沙星耐藥菌株，使耐藥大腸桿菌恢復(fù)對(duì)恩諾沙星的藥物敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌 大腸桿菌5株:均分離于健康豬肛拭子，1#(2009年分離于天津某健康豬場(chǎng))、2#(2009年分離于天津某健康豬場(chǎng))、3#(2008年分離于南寧某健康豬場(chǎng))、4#(2007年分離于江蘇某健康豬場(chǎng))和5#(2007年分離于江蘇某健康豬場(chǎng))，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所耐藥性監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室分離和鑒定;標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株CMCC 44113，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和水解酪蛋白肉湯，從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供。

1.3 藥品和試劑 恩諾沙星對(duì)照品(批號(hào)H0080807，含量 99.5%)、硫 酸小檗堿 (批號(hào)20080201，含量 90.0%)和鹽酸小檗堿(批號(hào)Z0220712，含量:98.7.0%)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;巴馬汀對(duì)照品(批號(hào):110732-200907，含量:100.0%)和鹽酸藥根堿(批號(hào):0733-200005，含量:100.0%)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;復(fù)方蒼術(shù)口服液(每100 mL相當(dāng)于原生藥366 g，批號(hào)20080802)和復(fù)方十大功勞顆粒(每50 g相當(dāng)于原生藥500 g，批號(hào)20080802)，由某單位提供;乙腈和甲醇為色譜純?cè)噭?磷酸二氫鉀、磷酸等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.4 藥物溶液的制備

1.4.1 恩諾沙星貯備液 準(zhǔn)確稱取恩諾沙星對(duì)照品約51.3 mg，先加約一半的水，然后滴加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解后，用水稀釋至10 mL，配制成5120 μg/mL的溶液。

1.4.2 硫酸小檗堿貯備液 取硫酸小檗堿210.5 mg，用水稀釋至25 mL，配制成8 mg/mL的溶液。

1.4.3 復(fù)方十大功勞貯備液的制備 取復(fù)方十大功勞顆粒1 g，加滅菌水10 mL溶解，制成每1 mL中含生藥1 g的溶液。

1.4.4 復(fù)方蒼術(shù)口服液貯備液 取原液作為貯備液

1.4.5 液相對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品和鹽酸藥根堿對(duì)照品適量，加乙腈-水(3∶7)混合溶液制成每1 mL含100 μg、50 μg 和50 μg 的溶液。

1.4.6 液相藥物溶液 取供試品1 g，精密稱重，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)混合溶液50 mL。超聲處理30 min，放冷，搖勻，濾過，即得。

1.5 主要儀器 高效液相色譜儀:Waters 2695色譜儀、2487紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器;數(shù)字比濁儀99234，威泰科學(xué)有限公司。

1.6 中藥制劑中生物堿含量的測(cè)定［4］以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)pH值至3.0)(30∶70)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。理論板數(shù)按小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。取液相對(duì)照品溶液和藥物溶液，分別用0.22 μm濾膜過濾后，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

1.7 最小抑菌濃度測(cè)定［5］取測(cè)試菌用劃線法涂布普通瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16～24 h，挑取3～4個(gè)單個(gè)菌落，用4 mL無菌生理鹽水配成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海肕-H肉湯稀釋100倍，配制成約5×105～106CFU/mL濃度。將各藥物貯備液用M-H肉湯稀釋10倍后，在96孔板的第1個(gè)孔中加入0.1 mL，然后按2倍稀釋法逐步稀釋至一系列所需濃度，每孔抗生素溶液體積為0.1 mL，設(shè)陰性和陽性對(duì)照。然后往各孔板中分別加入0.1 mL菌液，混勻。置35℃培養(yǎng)16～20 h，取出培養(yǎng)后的板，觀察結(jié)果，在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍［6］(恩諾沙星的 MIC 為 0.008 ～ 0.03 μg/mL)的前提下，以無菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物溶液的濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.8 中藥制劑的耐藥逆轉(zhuǎn)作用研究 取復(fù)方蒼術(shù)口服液0.25 mL和復(fù)方十大功勞顆粒0.25 g，分別加營(yíng)養(yǎng)肉湯至1 L，加入各試驗(yàn)菌從1代連續(xù)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:35±2℃，培養(yǎng)16～20 h。同時(shí)用肉湯培養(yǎng)基傳代作為陰性對(duì)照(營(yíng)養(yǎng)肉湯中不含藥物)。每代培養(yǎng)后測(cè)定耐藥菌對(duì)恩諾沙星的MIC，觀察MIC的變化。

1.9 染色體耐藥基因突變的檢測(cè) 根據(jù)Genbank公布的 gyrA、gyrB、parC和 parE這四種基因的QRDRs序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，引物序列為:gyrA F:TGCGATGTCGGTCATTGTT，R:CGTTCACCAGCAGGTTAGG。gyrB F:AAAAGCCAAAGTTAGCGCCACCG，R:CACGACCGATACCACAGCCAAGC。parC F:CGTGCGTTGCCGTTTATT，R:GCAGGTTATGCGGTGGAAT。ParEF:CGATGCGTGAGTTCTGTGA，R:GTTCGGCTTGCCTTTCTT。以煮沸法提取大腸桿菌DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，各對(duì)引物退火45s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。將陽性基因片段測(cè)序，確認(rèn)染色體DNA的突變狀況。

2 結(jié)果

2.1 中藥制劑中生物堿的含量 復(fù)方十大功勞顆粒中含有小檗堿、巴馬汀和藥根堿的濃度為0.01 mg/mL、0.006 mg/mL 和 0.02 mg/mL;復(fù)方蒼術(shù)口服液中未檢出上述3種成分。

2.2 大腸桿菌的MIC 采用從不同地區(qū)篩選分離得的5株豬源大腸桿菌測(cè)定，5株菌均對(duì)恩諾沙星不同程度的耐藥，測(cè)定的 MIC范圍為32～640 μg/mL，選擇5株作為測(cè)試菌株，耐藥狀況見表1。測(cè)定5株耐藥菌株對(duì)硫酸小檗堿、復(fù)方蒼術(shù)口服液和復(fù)方十大功勞顆粒的MIC，結(jié)果硫酸小檗堿對(duì)5株菌株的MIC均大于2 mg/mL;復(fù)方蒼術(shù)口服液和復(fù)方十大功勞顆粒對(duì)5株菌均無抑菌作用。

表1 5株菌對(duì)恩諾沙星和硫酸小檗堿的MIC

2.3 中藥制劑的耐藥逆轉(zhuǎn)作用 結(jié)果3株菌株在加有2種藥物培養(yǎng)基中傳代7代后，MIC均降低了8倍以上，耐藥株逆轉(zhuǎn)率為60%。陰性對(duì)照的MIC均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

2.4 染色體耐藥基因的測(cè)定結(jié)果 經(jīng)過中藥作用后，MIC降低的菌株，GyrA和ParC上發(fā)生了有意義的變化，由原來的耐藥突變狀態(tài)，恢復(fù)到了敏感的正常狀態(tài)。表3中列出了變化的堿基和氨基酸位點(diǎn)。2號(hào)菌株經(jīng)藥物作用以后，MIC降低的同時(shí)，GyrA上的83位氨基酸恢復(fù)為正常的氨基酸序列(Leu→Ser)。3號(hào)菌株P(guān)arC基因80位氨基酸也由原來的氟喹諾酮耐藥性突變狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檎顟B(tài)(Ile→Ser)，其他位點(diǎn)的氨基酸突變與氟喹諾酮耐藥性無關(guān)。

表2 中藥培養(yǎng)后恩諾沙星的MIC變化匯總表

表3 中藥作用前后菌株染色體堿基(氨基酸)的變化

3 討論

3.1 采用棋盤稀釋法考察中藥制劑與恩諾沙星聯(lián)用對(duì)5株大腸桿菌的抑菌效果，但聯(lián)用后無明顯的增效作用;而通過將中藥制劑加入大腸桿菌培養(yǎng)基中，選擇性培養(yǎng)耐藥性大腸桿菌，經(jīng)過一定代次后，細(xì)菌的耐藥性逆轉(zhuǎn)，MIC降低8倍以上，說明復(fù)方十大功勞顆?；驈?fù)方蒼術(shù)口服液與恩諾沙星聯(lián)用不能增強(qiáng)恩諾沙星對(duì)耐藥大腸桿菌的敏感性，但中藥制劑單獨(dú)作用卻可使耐藥細(xì)菌恢復(fù)敏感性，此時(shí)再用恩諾沙星治療就能取得較好療效。

3.2 復(fù)方十大功勞顆粒中含有小蘗堿、巴馬汀和藥根堿等有效中藥成分，復(fù)方蒼術(shù)口服液中不含上述成分，兩者雖然成分不相同，但均可逆轉(zhuǎn)大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的耐藥性，看來本試驗(yàn)中耐藥性的逆轉(zhuǎn)與上述3種成分無直接關(guān)系，可能是中藥各成分的綜合抗菌能力對(duì)細(xì)菌作用的結(jié)果，中藥通過消除R質(zhì)粒、抑制主動(dòng)外排泵和改變細(xì)菌生物膜的通透性等作用機(jī)制，從而使細(xì)菌恢復(fù)敏感性［7-9］。喹諾酮類藥物的一個(gè)主要耐藥機(jī)制:編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA和gyrB及編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV parC和parE的基因突變(gyrB和parE較少見)，臨床分離的雞大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥水平與GyrA和ParC的突變密切相關(guān)，3株細(xì)菌耐藥染色體基因突變導(dǎo)致的gyrA和ParC上的氨基酸替換是細(xì)菌恢復(fù)藥物敏感性的根本原因。秦春明等也通過試驗(yàn)研究，證明大黃素能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的耐藥性，對(duì)順鉑的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.91 倍和1.30 倍［10］，這是因?yàn)榕c耐藥基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。李乾學(xué)等提示臨床分離的雞大腸桿菌O78的耐藥水平與喹諾酮類藥物的選擇性壓力有關(guān)，它誘導(dǎo)了DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因突變［10］。

3.3 細(xì)菌耐藥性和耐藥菌感染是當(dāng)前急待解決的問題，但僅憑抗菌藥物又一時(shí)難以解決問題。中藥抗感染的歷史經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)為動(dòng)物的疾病治療發(fā)揮了重要作用。雖然中藥作為耐藥抑制劑還處于初級(jí)階段，中藥的作用機(jī)制探討不深，在今后的研究中應(yīng)當(dāng)以中醫(yī)辯證論治作理論指導(dǎo)，結(jié)合中藥四性五味，以現(xiàn)代藥物研究方法為手段，抓住治療耐藥細(xì)菌感染研究的契機(jī)，開拓中藥制劑治療耐藥菌感染的領(lǐng)域。

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