徐 俊，曹芳元，徐 敏，祝 圓，邱銀生

(武漢工業(yè)學(xué)院動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，武漢 430023)

頭孢噻呋具有廣譜殺菌作用，對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性包括產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶菌株均有效［1］。頭孢噻呋在豬、牛、馬等家畜體內(nèi)的藥動學(xué)已有研究［2-3］，牛、豬等肌內(nèi)注射頭孢噻呋后，吸收迅速，血液和組織中藥物濃度高，有效血藥濃度維持時間長，消除緩慢，半衰期長。頭孢噻呋在家禽體內(nèi)的藥動學(xué)研究較少，已見頭孢噻呋在雛鴨體內(nèi)的藥動學(xué)研究報道［4］。本試驗采用 HPLC 法［5］檢測血漿中的頭孢噻呋濃度，研究頭孢噻呋鈉在成年麻鴨體內(nèi)的藥動學(xué)特征，為頭孢噻呋鈉在成年麻鴨的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 脫呋喃甲酰頭孢噻呋(DFC)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司);注射用頭孢噻呋鈉凍干粉(齊魯動物保健品有限公司，批號1002005.1);二硫赤蘚糖醇(DTE，Sigma公司);三氟乙酸(TFA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);醋酸銨、硼砂(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 實驗動物 30只成年麻鴨購自武漢市黃陂區(qū)某鴨場，雌雄兼有，飼喂不含任何抗菌藥物的全價飼料。預(yù)飼一周后，體重在(1.6±0.2)kg，從中選取無臨床癥狀的健康鴨24只，供藥動學(xué)試驗用。

1.1.3 儀器設(shè)備 Waters 1525型高效液相色譜儀;Waters 2489型紫外/可見光檢測器;BF-S 2500C型固相萃取儀(北京八方世紀(jì)科技有限公司);TGL-16C型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法及樣品采集 24只健康的成年麻鴨隨機(jī)分為3組，試驗前禁食12 h，按2 mg/kg劑量單次靜脈注射、肌內(nèi)注射和灌服給藥。給藥后5、10、15 min 和0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h 采取鴨翼根靜脈血樣3 mL，置于肝素鈉抗凝管中，離心分離得到血漿，置于-20℃冰箱保存待測。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18柱(5μm，150 mm ×4.6 mm);檢測波長為 266 nm;流動相由乙腈(A)和0.1%TFA(B)組成，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 血漿樣品的預(yù)處理 取血漿樣品1 mL于離心管中，加入7 mL 0.4%DTE-硼酸鹽緩沖液，充分振蕩混合，在50℃水浴30 min。水浴結(jié)束后，取出冷卻至常溫，離心取上清液備用。用3 mL甲醇對Oasis HLB SPE小柱進(jìn)行潤洗活化，再用3 mL超純水沖洗平衡小柱。上述提取上清液過柱，調(diào)節(jié)流速讓其緩慢通過小柱，棄掉流出液。用3 mL超純水淋洗小柱，流出液棄掉。最后用2 mL乙腈-乙酸(體積比2∶3)洗脫液洗脫小柱，收集洗脫液，50℃水浴并用氮?dú)饬鞔蹈?。? mL 0.05%醋酸銨水溶液溶解，渦旋震蕩后超聲清洗5 min，用0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL進(jìn)樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限 稱取DFC標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.05%醋酸銨水溶液配制成40 μg/mL DFC標(biāo)準(zhǔn)液，取空白血漿1 mL，分別加入一定體積的DFC標(biāo)準(zhǔn)液，使得血漿中藥物濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，按“1.2.3”的方法處理，取20 μL進(jìn)行 HPLC檢測。將添加的DFC濃度與測得的峰面積進(jìn)行回歸，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信/噪比(S/N)=3時的最低藥物濃度為最低檢測限。

1.2.5 精密度的測定 取適量的 DFC標(biāo)準(zhǔn)液(40 μg/mL)，稀釋成0.5、2.5、10.0 μg/mL DFC 標(biāo)準(zhǔn)液，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液在同1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，連續(xù)測定3 d，計算色譜峰面積的日內(nèi)、日間相對偏差(RSD)。

1.2.6 回收率的測定 取空白血漿1 mL，添加適量40 μg/mL DFC標(biāo)準(zhǔn)液，使得血漿中藥物濃度分別為 0.5，2.5，10.0 μg/mL，按“1.2.3”方法處理后，所測得的峰面積與同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的比值，計算藥物提取回收率，每一濃度重復(fù)5次。

1.2.7 藥動學(xué)參數(shù)計算 血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用DAS(Drug and Statistics)軟件進(jìn)行房室模型擬合，求得藥動學(xué)參數(shù)。

2 試驗結(jié)果

2.1 色譜圖 采用梯度洗脫，DFC的保留時間約為13.2 min。色譜圖可見基線較平穩(wěn)，且藥物峰與血漿中其他組分分離良好，雜峰不干擾藥物峰(圖1)。

圖1 標(biāo)液、空白樣品、添加樣品和實際樣品得到的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限 結(jié)果顯示，在0.25～20 μg/mL范圍內(nèi)藥物濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，r=0.9997，回歸方程為 y=11495.54x+3786。本試驗條件下，DFC的最低檢出濃度為0.1 μg/mL。

2.3 精密度的測定結(jié)果 測定不同濃度DFC的峰面積，求出其日內(nèi)和日間RSD(表2)。結(jié)果表明，儀器檢測的日內(nèi)和日間精密度良好。

表2 精密度的測定結(jié)果(n=5)

2.4 回收率的測定結(jié)果 血漿中 DFC濃度在0.25 ～20μg/mL 范圍內(nèi)，回收率為 84.7% ～91.9%，RSD 為5.35% ～6.55%(表3)。

表3 回收率的測定結(jié)果(n=5)

2.5 血藥經(jīng)時數(shù)據(jù)與血液藥動學(xué)參數(shù)

2.5.1 血藥經(jīng)時數(shù)據(jù) 肌內(nèi)注射、靜脈注射和內(nèi)服頭孢噻呋鈉后的血藥經(jīng)時曲線見圖2。

圖2 單次給藥后的血藥濃度經(jīng)時曲線(2 mg/kg，n=8)

2.5.2 血液藥動學(xué)參數(shù) 單劑量2 mg/kg肌注頭孢噻呋的生物利用度為99.22% ，內(nèi)服的生物利用度為79.25% 。藥動學(xué)參數(shù)見表4。

3 討論

頭孢噻呋在體內(nèi)生成一級代謝物脫呋喃甲酰頭孢噻呋(DFC)。頭孢噻呋在奶牛、豬的代謝研究顯示，在這一過程中β-內(nèi)酰胺環(huán)未受破壞，DFC抗菌活性與頭孢噻呋相似［6-7］。頭孢噻呋在動物體內(nèi)主要以代謝物DFC的形式存在，已報道的頭孢噻呋藥動學(xué)研究中檢測物質(zhì)也為DFC［4-5］。本試驗檢測方法利用DTE切斷DFC與蛋白的結(jié)合，固相萃取柱凈化后進(jìn)行HPLC檢測，操作簡便、結(jié)果可靠。HPLC檢測以梯度洗脫的方式進(jìn)行，該條件下DFC峰與樣品中其他雜質(zhì)峰分離效果好，基線平穩(wěn)且峰形良好。樣品預(yù)處理后日內(nèi)、日間平均相對標(biāo)準(zhǔn)差均低于10%，符合生物樣品分析要求。

表4 靜脈注射、肌內(nèi)注射與內(nèi)服頭孢噻呋(2 mg/kg)后的血液動力學(xué)參數(shù)

現(xiàn)普遍認(rèn)為頭孢噻呋內(nèi)服吸收較少，臨床使用的頭孢噻呋也僅有注射制劑。本試驗研究表明，成年麻鴨內(nèi)服頭孢噻呋后，吸收較為迅速，血中藥物濃度較高，有效血藥濃度維持時間長，生物利用度達(dá)到79.25%，說明該藥可以被麻鴨內(nèi)服吸收;肌內(nèi)注射后，吸收迅速，血中藥物濃度高，生物利用度達(dá)到99.22%。劉明春等［4］也曾報道雛鴨內(nèi)服頭孢噻呋吸收良好，生物利用度達(dá)到89.54%;Amer等［8］報道30日齡的雞單次內(nèi)服10 mg/kg時，血藥峰濃度達(dá)為(27.83 ±1.28)μg/mL，達(dá)峰時間(2.39 ±0.07)h。

Ritter等［9］報道大鼠、牛和豬內(nèi)服頭孢噻呋后，約55%的藥物會由尿液排泄，30%由消化道及糞便排泄，吸收藥物在體內(nèi)充分代謝后的產(chǎn)物以DFC為主，其中牛的總代謝產(chǎn)物中DFC占87%。在本實驗中，盡管不能準(zhǔn)確判斷DFC是由體內(nèi)代謝還是測定時轉(zhuǎn)化所得，但是由于DFC與頭孢噻呋的抗菌活性相似［10］，可以認(rèn)為鴨內(nèi)服頭孢噻呋后可發(fā)揮抗菌效果。

綜上所述，建議在獸醫(yī)臨床治療鴨的急性感染性病例時，優(yōu)先采用肌內(nèi)注射給藥，若需群體給藥時也可以采取混飲或混飼給藥方式。

［1］焦 陽，劉明春，陳曉慧，等.頭孢噻呋的體外抗菌后效應(yīng)研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(2):90-91.

［2］Brown S A，Chester S T，Robb E J.Effects of age on the pharmacokinetics of single dose ceftiofur sodium administered intramuscularly or intravenously to cattle［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1996，19(1):32-38.

［3］Brown S A，Hanson B J，Mignot A，et al.Comparison of plasma pharmacokinetics and bioavailability of ceftiofur sodium and ceftiofur hydrochloride in pigs after a single intramuscular injection［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1999，22(1):35-40.

［4］劉明春，焦 陽，李 杰，等.頭孢噻呋在雛鴨體內(nèi)的血液動力學(xué)及生物利用度研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41(3):346～349.

［5］李長流，俞道進(jìn)，馬玉芳，等.豬血漿中去呋喃甲?；^孢噻呋濃度的HPLC測定［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，39(1):58-62.

［6］Jaglan P S，Yein F S，Hornish R E，et al.Depletion of intramuscularly injected ceftiofur from the milk of dairy cattle［J］.Journal of Dairy Science，1992，75(7):1870-1876.

［7］Gilbertson T J，Roof R D，Nappier J L，et al.Disposition of ceftiofur sodium in swine following intramuscular treatment［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43(1):229-234.

［8］Amer A M，F(xiàn)ahim E M，Ibrahim R K.Effect of aflatoxicosis on the kinetic behaviour of ceftiofur in chickens［J］.Research in Veterinary Science，1998，65(2):115-118.

［9］Ritter L，Kirby G，Cerniglia C.WHO Food-Additives Series［R］.1996:59.

［10］ Salmon S A，Watts J L，Yancey R J.In vitro activity of ceftiofur and its primary metabolite，desfuroylceftiofur，against organisms of veterinary importance［J］.Journal of Dairy Science，1996，8(3):332-336.