王 玉，李 靜，張 莉，曹 玲

(1.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210008;2.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009)

首烏丸是由制何首烏、地黃、牛膝、桑葚等十四味中藥經(jīng)提取制成的復(fù)方中藥制劑，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，烏須發(fā)之功效，用于治療肝腎兩虛，頭暈?zāi)炕?，耳鳴，腰酸肢麻。何首烏為方中君藥，且處方量最大，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷及大黃蒽醌類成分為其主要有效成分，其中2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷具有顯著的降低血脂、降膽固醇和保護(hù)肝臟的作用，蒽醌類成分由于炮制過(guò)程中結(jié)合蒽醌的減少也主要發(fā)揮補(bǔ)益作用。中國(guó)藥典(2005年版)一部何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)二苯乙烯苷進(jìn)行定量控制［1］，有報(bào)道酸水解樣品前后，醋酸鎂比色法測(cè)定何首烏藥材中游離蒽醌和總蒽醌的含量，比較不同產(chǎn)地何首烏中蒽醌類化合物的含量［2］。但比色法操作繁瑣，誤差較大。在前文采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定首烏丸中大黃素的含量基礎(chǔ)上［3］，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用法對(duì)首烏丸中的五種蒽醌類水解前后含量進(jìn)行測(cè)定，使首烏丸質(zhì)量評(píng)價(jià)從單一指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)變?yōu)槎喑煞志C合指標(biāo)。

1 儀器和試藥

FinniganTMAccela uHPLC/TSQ quantum Access聯(lián)用系統(tǒng)(含LC泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，電噴霧離子化接口的三重四級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)器以及Xcalibur2.0色譜工作站)。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品(含量測(cè)定用)由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

首烏丸由云南廣福藥業(yè)有限公司、蘇州雷允上藥業(yè)有限公司等提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna C18(3μm，150 mm×2 mm)，流動(dòng)相:甲醇-5 mmol/L醋酸銨溶液(90∶10)，流速:0.2mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式:電噴霧離子化(ESI);選擇反應(yīng)掃描檢測(cè)(SRM);ESI離子源噴霧電壓3 500 V;毛細(xì)管溫度:300℃;鞘氣壓力為15 arb，輔助氣壓力為5 arb，負(fù)離子方式掃描。碰撞誘導(dǎo)解離電壓分別為大黃酸32 V，蘆薈大黃素17 V，大黃素29 V，大黃酚26 V和大黃素甲醚24 V。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 283.0→183.1(大黃酸)，m/z 269.0→239.0(蘆薈大黃素)，m/z 269.0→225.0(大黃素)，m/z 253.0→225.0(大黃酚)，m/z 283.2→240.0(大黃素甲醚)，見(jiàn)圖1。

圖1 五種蒽醌類化合物的MS圖Fig.1 Mass spectra of five phenolic compounds

2.3 樣品的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，使成每1mL含大黃酸11.32 ng、蘆薈大黃素10.03 ng、大黃素14.94 ng、大黃酚 11.33 ng、大黃素甲醚6.85 ng的甲醇溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，水浴回流1 h，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為測(cè)定游離蒽醌的供試品溶液;再精密量取續(xù)濾液10mL，置錐形瓶中，水浴揮干，加2.5 mol/L硫酸20mL，振搖混勻后沸水浴回流1 h，放冷，移至分液漏斗中，酸水液用乙醚提取3次，每次20mL，合并乙醚液，水浴揮干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解，移置10mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為測(cè)定總蒽醌的供試品溶液。對(duì)照品和供試品的SRM譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 五種蒽醌化合物對(duì)照品(1)和樣品(2)的SRM圖Fig.2 SRM chromatograms of five phenolic compounds of chemical reference standards(1)and the samples(2)

2.4 線性關(guān)系考察

取大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制定容，分別稀釋使成含大黃酸 1.80，9.10，45.2，226.4，566，1 132，5 660 ng/mL;蘆薈大黃素1.60，8.00，40.1，200.6，501.5，1 003 ng/mL;大黃素2.40，12.0，59.8，298.8，747，1 494 ng/mL;大黃酚 1.80，9.00，45，226.6，566.5，1 133 ng/mL;大黃素甲醚 1.10，5.40，27.4，137，342.5，685 ng/mL 的對(duì)照品溶液。分別取10μL進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)下色譜條件分離和2.2項(xiàng)下質(zhì)譜條件測(cè)定離子流峰面積;以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果Tab.1 The result of linear test for five phenolic compounds

2.5 中間精密度試驗(yàn)

配制濃度約為200 ng/mL的對(duì)照品溶液，按2.4項(xiàng)下操作，分別在日內(nèi)0，1，3，5，7，10 h 和日間0，1，2，3，5，7d記錄樣品的離子流峰面積，測(cè)定日內(nèi)、日間變異，結(jié)果表明建立的方法精密度好，日內(nèi)及日間誤差(RSD)均小于2%。

2.6 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液(云南廣福藥業(yè)有限公司，批號(hào):20051001)在0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h 分別進(jìn)樣10μL，按2.4項(xiàng)下操作，記錄樣品的離子流峰面積，結(jié)果游離大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的峰面積的RSD分別為1.67%，1.48%，1.82%，1.83%和1.78%，總蒽醌測(cè)定中大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的峰面積的RSD 分別為1.54%，1.16%，1.44%，1.29%和1.54%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同批樣品(云南廣福藥業(yè)有限公司，批號(hào):20051001)，按2.4項(xiàng)下操作，平行測(cè)定6份。結(jié)果游離大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量的RSD分別為1.06%，1.34%，1.52%，0.64%和1.46%，總蒽醌測(cè)定中含量的RSD分別為0.83%，1.12%，1.24%，0.56%和1.28%。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品(云南廣福藥業(yè)有限公司，批號(hào):20051001)約0.125 g，平行6 份，精密稱定，分別添加精密量取的對(duì)照品溶液適量，按2.4項(xiàng)下操作，測(cè)定含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab.2 The results of recovery tests(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

取本品，按2.3.2項(xiàng)下方法分別制備游離葸醌和總蒽醌的樣品溶液，取樣品溶液和對(duì)照品溶液各10μL，按2.4項(xiàng)下操作，記錄樣品的離子流峰面積，測(cè)定，計(jì)算。各廠家所有批號(hào)樣品水解前后均未檢出大黃酸和蘆薈大黃素。大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中各成分測(cè)定結(jié)果(ng/g)Tab.3 The result of determinations for five phenolic compounds

3 討論

何首烏中蒽醌類化合物分為游離型和結(jié)合型兩種，結(jié)合型具有解毒消腫、潤(rùn)腸通便的功效，游離型具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨等功效。本品選用制何首烏入藥，是因?yàn)榕谥茣r(shí)可以減少結(jié)合蒽醌的含量，使補(bǔ)益作用更加突出。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)游離型和總蒽醌類化合物分別進(jìn)行了測(cè)定，通過(guò)對(duì)游離型和結(jié)合型蒽醌類化合物的含量的測(cè)定全面控制首烏丸的質(zhì)量。

首烏丸中制何首烏處方量最大，其中蒽醌類化合物為其主要成分且含量較高，因此選用大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚五種蒽醌類化合物作為多成分指標(biāo)。在實(shí)際樣品中未能檢出大黃酸和蘆薈大黃素，僅在其中一個(gè)批號(hào)中檢出大黃酚，但是在何首烏中這些成分均存在，只是隨產(chǎn)地、采收環(huán)境等因素而不同，同時(shí)考察這些指標(biāo)是有實(shí)際意義的。

首烏丸處方復(fù)雜，這五種蒽醌類化合物在HPLC色譜條件下完全分離，故選用HPLC-MS聯(lián)用法實(shí)現(xiàn)了這五種物質(zhì)的完全分離，并用SRM法進(jìn)行了定量分析。其中大黃酸的分子離子峰為m/z 283，失去一分子CO2后形成碎片離子m/z 239，進(jìn)一步失去一個(gè)CO形成碎片離子m/z 211，再失去一分子CO形成碎片離子m/z 183;蘆薈大黃素和大黃素都含有分子離子峰m/z 269，但是蘆薈大黃素失去一分子CO2和一分子CO后分別形成碎片離子m/z 241和225，而大黃素失去一分子CHO后形成一個(gè)主要的碎片離子m/z 240;大黃酚中m/z 225為準(zhǔn)分子離子峰m/z 253失去中性CO產(chǎn)生的碎片［M-H-CO］－;大黃素甲醚的二級(jí)質(zhì)譜中，m/z 240為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子CH3后再失去一羰基后的碎片［M-H-CH3-CO］－。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，各廠家樣品中，五種蒽醌類成分含量存在比較大的差異，有些甚至測(cè)不出來(lái)，如大黃酸、蘆薈大黃素和大黃酚;樣品中主要含有大黃素和大黃素甲醚，但大黃素和大黃素甲醚的含量也存在較大的差異。中國(guó)藥典目前未對(duì)首烏丸中蒽醌類成分建立含量測(cè)定指標(biāo)［1］，因此為了保證首烏丸的質(zhì)量和臨床療效，應(yīng)建立專屬性的測(cè)定方法，對(duì)此類成分的含量予以控制。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:122-123，545-546.

［2］左紅香，金 勇，尹壽玉.不同產(chǎn)地何首烏中有效成分蒽醌的含量比較［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21(1):76-77.

［3］李 靜，張 莉，曹 玲，等.高效液相色譜法測(cè)定首烏丸中大黃素的含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(2):118-120.