向 維，陳松華，李朝品

(1.中國(guó)人民解放軍 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 療養(yǎng)區(qū)(全軍醫(yī)學(xué)康復(fù)中心)，江蘇 南京 211131;2.皖南醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

我們前面的研究已經(jīng)證實(shí)彩虹明櫻蛤多糖(Moerella iridescens polysaccharide，MIP)對(duì)小鼠的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用［1］，是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。本研究采用小鼠CCl4肝損傷模型，觀察了MIP對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料

MIP的制備同文獻(xiàn)［1］。

聯(lián)苯雙酯滴丸(biphenyl dimethy dicarboxylate，BDD)，浙江萬(wàn)邦藥業(yè)有限公司;氯仿、正丁醇、四氯化碳、橄欖油，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

BALB/c雌性昆明種小鼠，13～15周齡，體重18～22 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，許可證號(hào):SCXK(蘇)2007-0001。

721分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司;CF16RX高速低溫離心機(jī)，日立公司。

2 方法

昆明種小鼠60只隨機(jī)等分成6組:正常對(duì)照組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組(200mg/kg)、MIP低、中、高劑量組(40，80，160mg/kg)。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d后，正常對(duì)照組及CCl4模型組ip生理鹽水;聯(lián)苯雙酯滴丸組和MIP低、中、高劑量組分別ip相應(yīng)劑量藥物的生理鹽水溶液。給藥體積均為0.1mL/10g，1次/d，連續(xù)給藥7d。于末次給藥2h后，正常對(duì)照組ip橄欖油溶液0.1mL/10g，其余5組均ip等量0.1%CCl4橄欖油溶液。禁食不禁水，24 h后稱(chēng)體重，摘眼球取血。血液3 000r/min離心10min，取血清超低溫冰箱凍存待測(cè)。采血后快速斷頭處死小鼠，剖取肝臟，取肝右葉組織0.5 g在冰生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，用生理鹽水制成10%肝組織勻漿，離心取上清待測(cè)。同時(shí)取左葉相同部位肝臟，迅速投入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片HE染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化［2］。

按試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清ALT和AST，組織勻漿MDA、SOD和GSH。計(jì)算肝臟指數(shù):(肝臟重量/體重)。

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行動(dòng)物隨機(jī)分組，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(±s)表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝臟指數(shù)檢測(cè)

MIP中、高劑量組比模型組略有降低，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液后，小鼠血清ALT、AST水平明顯升高，MIP能顯著降低肝損傷小鼠血清ALT和AST水平(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 肝組織勻漿生化指標(biāo)檢測(cè)

與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高，SOD與GSH活性顯著下降，提示肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化。而MIP中、高劑量組可顯著抑制肝組織中MDA的升高(P＜0.01)，并使SOD和GSH活性明顯升高(P＜0.05)，提示MIP有較強(qiáng)的抗氧化及清除氧自由基的作用，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 MIP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表1 MIP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的影響(n=10，±s)Tab.1 Effects of MIPon liver index，and the activities of ALT and AST in serum of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

與模型組比較:1 P＜0.05，2P＜0.01Compared with model group:1P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 中劑量組 80 463.38±23.46 52.89±12.1489.26±28.89 MIP 高劑量組 160 452.23±27.66 41.28±14.362 74.12±27.972

表2 MIP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD和GSH的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

表2 MIP對(duì)CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD和GSH的影響(n=10，±s)Tab.2 Effects of MIPon MDA and SOD and GSH in hepatic homogenate of acute hepatic injury mice induced by CCl4(n=10，±s)

與模型組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with model group:1 P＜0.05，2 P＜0.01

MIP 低劑量組 40 3.92±1.481 48.23±1.661 28.36±2.281 MIP 中劑量組 80 3.65±0.562 52.77±1.582 31.37±0.761 MIP 高劑量組 160 3.33±0.372 54.49±1.162 33.85±1.332

3.4 肝臟組織病理學(xué)觀察

正常對(duì)照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，質(zhì)地濕潤(rùn)、柔軟有光澤且富于彈性;光學(xué)顯徽鏡下可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰;肝細(xì)胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn);肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富，含嗜堿性物質(zhì)較多，核大而圓，見(jiàn)圖1A。CCl4模型組小鼠肝臟體積增大，質(zhì)脆邊緣鈍而厚，表面呈黃褐色;鏡下見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞核消失，出現(xiàn)以中央靜脈為中心的局灶性肝細(xì)胞變性、壞死和大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1B。聯(lián)苯雙酯滴丸組小鼠肝臟顏色較紅潤(rùn)，有部分肝細(xì)胞有胞漿疏松，氣球樣變現(xiàn)象，見(jiàn)圖1C。MIP低劑量組肝臟雖未完全表現(xiàn)為正常對(duì)照組的紅褐色，但較模型組有明顯改觀;切片可見(jiàn)病變以中央靜脈周?chē)渭?xì)胞的氣球樣變?yōu)橹?，肝?xì)胞腫大，胞漿疏松，中央靜脈周?chē)猩倭扛渭?xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞入侵，見(jiàn)圖1D。MIP中劑量組肝臟顏色較紅潤(rùn);切片可見(jiàn)有部分肝細(xì)胞有氣球樣變，但并無(wú)炎癥細(xì)胞入侵和明顯壞死，見(jiàn)圖1E。MIP高劑量組小鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，接近正常對(duì)照組，僅有少量肝細(xì)胞有胞漿疏松現(xiàn)象，見(jiàn)圖1F。

圖1 各組肝組織切片HE染色結(jié)果(×200)Fig.1 Light microscopy showing liver tissue in each group(HE staining，× 200)

4 討論

正常肝組織ALT主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，AST則分布于線粒體中。在CCl4模型中，CCl4在肝微粒體細(xì)胞色素P450激活下生成三氯甲基自由基，這些自由基可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，也可攻擊膜不飽和脂質(zhì)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶從受損的肝細(xì)胞內(nèi)溢出，使血清中轉(zhuǎn)氨酶升高［3］。因此，ALT和AST的升高是肝炎活動(dòng)的重要標(biāo)志。SOD是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶，其作用是清除自由基，防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，體內(nèi)SOD的活性，可以反映自由基的清除速度。MDA是不飽和脂肪酸氧化作用的終產(chǎn)物，它在血清中的含量可以間接反映自由基反應(yīng)時(shí)組織的破壞程度。MDA的測(cè)定常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［4］。因此，SOD及MDA可反映肝細(xì)胞損傷的程度和藥物對(duì)肝細(xì)胞的拮抗作用。GSH廣泛存在于人體的各種組織中，GSH水平降低意味著機(jī)體抗氧化能力下降，并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基。在肝臟化學(xué)性損傷時(shí)，氧化應(yīng)激消耗GSH引起肝臟GSH含量下降，機(jī)體抗氧化能力下降，并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)［5］。研究證實(shí)，多糖能夠提高SOD、GSH等抗氧化物酶的活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量［6］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIP 3個(gè)劑量組能不同程度降低肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝勻漿MDA水平，能不同程度增高肝損傷小鼠肝勻漿SOD和GSH的水平，且對(duì)小鼠肝臟的病理學(xué)損傷也有明顯改善。據(jù)此推斷，MIP對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)提高SOD等抗氧化物酶的活性，從而清除自由基，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，起到保護(hù)肝臟的作用。對(duì)MIP抗氧化的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］向 維，陳松華，李朝品.彩虹明櫻蛤多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(5):393-395.

［2］陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:943.

［3］Ozercan I H，Dagli A F，Ustundag B，etal.Does instant coffee prevent acute liver injury induced by carbon tetrachloride［J］.Hepatol Res，2006，35(3):163-165.

［4］Basn S.Carbon tetrachloride induced lipid peroxidation:eicosanoid formation and their regulation by antioxidant nutrien［J］.Toxicology，2003，189(2):113-127.

［5］Mehmetcik G，Ozdemirler G，Kocak T N，etal.Effect of pretreatment with artichoke extracton carbon tetrachloride-induced liver injury and oxidative stress［J］.Exp Toxicol Pathol，2008，60(1):475-480.

［6］周林珠，楊祥良，周井炎，等.多糖抗氧化作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002，23(4):210-212.