彭湘萍 苑 聰 姜志勝 任 重 趙戰(zhàn)芝 卜梓斌 唐志晗 劉錄山 黃宜娥 聶德波

肖文虎1，2 劉艷文1，2 (吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

組織因子途徑抑制物(TFPI)是近年發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的生理性抗凝物質(zhì)，有兩種異構(gòu)體：TFPI-1和TFPI-2，前者主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，在抑制血栓形成和血管重塑等方面發(fā)揮重要作用〔1〕。血漿中的天然高密度脂蛋白(HDL)具有直接的抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和血管保護(hù)作用〔2〕。利用密度梯度超速離心可將 HDL 分為 HDL1、HDL2、HDL3三類〔3〕。Asztalos 等〔4〕報(bào)道HDL對心血管的保護(hù)作用與HDL亞型在血中的相對含量、顆粒大小有關(guān)，而HDL亞型分布異?？赡苁怯绊慉S發(fā)生的重要原因。已有學(xué)者提出血清HDL亞型組成及含量變化可作為評價(jià)AS危險(xiǎn)性及其嚴(yán)重程度的一個(gè)指標(biāo)〔5〕。本研究旨在探索oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，為闡明oxHDL及其亞型在AS血栓形成中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12細(xì)胞株來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心;RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物公司);兔抗人TFPI-1多克隆抗體，羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa cruz);β-actin鼠抗人一抗，兔抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司);BCA蛋白定量檢測試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);引物均由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 HDL及其亞型的制備、氧化與鑒定 健康人血漿購自衡陽市血站。采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法〔6〕密度梯度超速離心分離HDL(1.063 ～1.21 g/ml)、HDL2(1.063 ～1.125 g/ml)、HDL3(1.125～1.21 g/ml)，固體KBr調(diào)密度。將分離的HDL、HDL2、HDL3均分成兩部分，一部分用含0.1%EDTA的PBS溶液透析48 h;另一部分同樣方法進(jìn)行透析后，1 mg/ml HDL、HDL2和HDL3分別在37℃與含20 μmol/L CuSO4的PBS溶液孵育24 h進(jìn)行氧化修飾。BCA法蛋白定量，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。瓊脂糖凝膠電泳法及硫代巴比妥法鑒定oxHDL及其亞型修飾情況。取氧化前后的 HDL、HDL2、HDL3經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，2.5%考馬斯亮藍(lán)常規(guī)染色，脫色后可見清晰的脂蛋白和氧化修飾脂蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)掃描收集圖像。按MDA試劑盒操作方法，532 nm處可見光分光光度計(jì)測各管吸光度值，計(jì)算MDA含量。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 收集細(xì)胞，總RNA提取試劑提取總RNA，各標(biāo)本取0.2 g總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。TFPI-1引物序列上游：5'-CAACTCTGATACAAACGTGTTGA-3'，下游 5'-CTACTACAATTCAGTCATTGGGA-3'，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度374 bp;內(nèi)參照采用GAPGH，引物序列上游 5'-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3'，下游 5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'，PCR擴(kuò)增長度為697 bp。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min繼續(xù)延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶拍照以及分析，以各組目的基因與內(nèi)參基因的吸光度值的比值比較目的基因mRNA表達(dá)差異。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western印跡 將變性過的蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度為12%，電泳后半干轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉4℃過夜，一抗以最佳濃度稀釋后常溫2 h或4℃孵育12 h，TBST洗膜3×15 min，洗膜后用相應(yīng)辣根過氧化物酶二抗常溫孵育2 h，TBST洗膜3×15 min，暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 HDL氧化修飾鑒定 HDL及其亞型經(jīng)CuSO4孵育后，HDL、HDL2、HDL3中 MAD 含 量 分 別 由 2.82、2.95、3.46 nmol/ml升至 29.23、30.64、37.18 nmol/ml，具有顯著性差異(P＜0.01)。說明氧化后MDA含量增高，HDL及其亞型發(fā)生了氧化修飾。同時(shí)，由于陰離子含量增多，氧化修飾后電泳遷移率明顯加快，表明已被氧化修飾。見圖1。

2.2 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對 HUVECs細(xì)胞TFPI-1mRNA表達(dá)的影響 不同濃度的HDL、HDL2、HDL3孵育HUVECs細(xì)胞24 h后，各濃度組TFPI-1 mRNA表達(dá)變化不明顯。用不同濃度的 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3(10、20、40、80 mg/L)孵育HUVECs細(xì)胞24 h后，各濃度組TFPI-1 mRNA的表達(dá)均有所減少，其中在oxHDL和oxHDL3各系列濃度中以40 mg/L時(shí)作用最明顯，TFPI-1 mRNA表達(dá)分別為0 mg/L組的72%、51%，下降了28%、49%;在 oxHDL2各系列濃度中以80 mg/L作用最明顯，TFPI-1 mRNA表達(dá)為0 mg/L組的73%，下降了27%，差異均具有(P＜0.05)。見圖2。

2.3 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對 HUVECs細(xì)胞TFPI-1蛋白表達(dá)的影響 與0 mg/L組比較，不同濃度的ox-HDL、oxHDL2、oxHDL3(10、20、40、80 mg/L)組 TFPI-1 蛋白表達(dá)減少，其中在oxHDL和oxHDL3各系列濃度中以40 mg/L作用最明顯，TFPI-1蛋白表達(dá)分別為0 mg/L組的65%、53%，下降了35%、47%;在oxHDL2各系列濃度中以80 mg/L時(shí)作用最明顯，TFPI-1蛋白表達(dá)是0 mg/L組的73%，下降了27%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3，表1。

圖1 oxHDL、HDL及其亞型瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達(dá)的影響(s)

表1 不同濃度 oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達(dá)的影響(s)

濃度(mg/L)oxHDL oxHDL2 oxHDL3 0 0.823±0.022 0.945±0.053 0.555±0.051 10 0.820±0.047 0.914±0.064 0.547±0.042 20 0.677±0.035 0.790±0.032? 0.456±0.033 40 0.532±0.030 0.732±0.025 0.292±0.024 80 0.547±0.012 0.691±0.055 0.312±0.034

圖2 不同濃度oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1 mRNA表達(dá)的影響

圖3 不同濃度oxHDL、oxHDL2、oxHDL3對TFPI-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

oxHDL是導(dǎo)致AS的一個(gè)危險(xiǎn)因素。HDL發(fā)生氧化修飾以后，其化學(xué)組成成分、化學(xué)性質(zhì)以及生物學(xué)功能均發(fā)生變化，轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力下降，喪失了抑制LDL氧化修飾的能力，破壞凝血和纖溶平衡，引起血小板聚集。促進(jìn)AS發(fā)生。文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕，oxHDL能抑制內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)的合成和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素-1(ET-1)，影響血管正常的舒張和收縮功能。oxHDL可上調(diào)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)表達(dá)，使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成增多，造成內(nèi)皮功能不良。體外研究發(fā)現(xiàn)，oxHDL引起的凝血酶原時(shí)間(PT)及活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)明顯短于 HDL〔8〕。Giuseppe等〔9〕報(bào)道，oxHDL3通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)mRNA表達(dá)和相應(yīng)的抗原生成，加速血栓形成。

本研究發(fā)現(xiàn)oxHDL及其亞型能抑制HUVECs TFPI-1 mRNA和蛋白表達(dá)，其中oxHDL3的作用最強(qiáng)。TFPI是外源性凝血途徑起始步驟的生理性抑制物，是目前唯一能抑制組織因子(TF)活性的生理活性物質(zhì)，TFPI-1對AS及其并發(fā)癥有拮抗作用。文獻(xiàn)報(bào)道，在AS斑塊破裂之前，TFPI和TF同時(shí)出現(xiàn)在壞死區(qū)周圍的巨噬細(xì)胞以及纖維帽的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中，但在脂質(zhì)豐富區(qū)卻只有TF而沒有TFPI，提示如果缺乏TFPI對TF的抑制作用，易引起 AS并發(fā)癥〔10〕。Westrick 等〔11〕通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)TFPI能有效地防止AS的發(fā)生并能減少血栓的形成。內(nèi)源性TFPI-1活性降低可促進(jìn)血栓形成〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死、冠狀動(dòng)脈局部缺血等疾病中，血漿中TFPI-1水平較高，TFPI-1水平增高可抑制TF引起的血栓形成〔13〕。陳瑩等〔14〕研究結(jié)果表明，急性冠脈綜合征患者 TF、TFPI水平較穩(wěn)定型心絞痛病人和對照組明顯增高，提示存在凝血機(jī)制異常。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)oxHDL及其亞型可呈濃度和時(shí)間依賴性增加TF的表達(dá)，作用強(qiáng)弱不一，以oxHDL3的效應(yīng)最顯著〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合前期研究提示oxHDL及其亞型誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF、抑制TFPI-1可能是AS血栓形成的重要機(jī)制，而oxHDL3似在其中扮演著更重要的角色。脂蛋白氧化修飾后不僅影響血管內(nèi)皮細(xì)胞TF的分泌，也可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-1的表達(dá);而TFPI-1作為重要的體內(nèi)抗凝物質(zhì)，其表達(dá)下降;對TF的抑制作用降低，體內(nèi)抗凝/促凝平衡被打破，抗凝作用減弱，促進(jìn)血栓的形成，從而可能加速了AS的進(jìn)程。

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