石衛(wèi)民 高 蕾 陳龍華 宋維舒 (廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤一科，廣東 廣州 5037)

兒茶素對受照射大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及對TGF-β表達(dá)的影響

石衛(wèi)民 高 蕾1陳龍華2宋維舒 (廣東省第二人民醫(yī)院腫瘤一科，廣東 廣州 510317)

目的 闡明兒茶素對大鼠急性放射性肺損傷的保護(hù)作用及肺組織TGF-β表達(dá)水平的影響。方法 成年雌性Wistar大鼠40只，隨機分作4組：(1)空白對照組：10只，腹腔注射生理鹽水20 ml·kg－1·d－1。(2)單純兒茶素組：10只，腹腔注射兒茶素注射液100 mg· kg－1·d－1。(3)單純照射組：10只，全肺單次照射15 Gy+腹腔注射生理鹽水20 ml·kg－1·d－1。(4)照射+兒茶素組：10只，全肺單次照射15 Gy+兒茶素注射液100 mg·kg－1·d－1。于照射后2 w及6 w取各組大鼠5只，取肺組織作組織學(xué)與免疫組化分析。結(jié)果 照射組大鼠2 w和6 w時肺出現(xiàn)明顯炎性損傷，照射+兒茶素組的急性肺炎性改變較照射組明顯減輕;空白對照組和單純兒茶素組動物免疫組化TGF-β陽性細(xì)胞數(shù)相對較低，單純照射組的TGF-β陽性細(xì)胞數(shù)較上述兩組明顯增高(P＜0.05)，照射+兒茶素組的陽性細(xì)胞數(shù)介于兩者之間，也顯著低于單純照射組(P＜0.05)。結(jié)論 兒茶素對大鼠急性放射性肺損傷具有保護(hù)作用，而兒茶素能明顯降低該過程中TGF-β表達(dá)水平。提示兒茶素可能通過調(diào)控該細(xì)胞因子而起到輻射防護(hù)的作用。

兒茶素;肺;輻射損傷;TGF-β

射線輻射可以導(dǎo)致機體產(chǎn)生各種損傷，引起突變，誘發(fā)腫瘤及引起衰老。主要機制是放射線作用使機體產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。近年來有研究發(fā)現(xiàn)兒茶素是一種有效的羥自由基清除劑，能有效清除多種自由基，使射線的間接作用對機體損傷大為減少，從而起到輻射防護(hù)作用〔1〕。兒茶素主要有4種單體成分：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，有研究發(fā)現(xiàn)其單體及混合體對不同組織具有不同程度的輻射防護(hù)作用，其研究見于對于外周血淋巴細(xì)胞、小腸絨毛細(xì)胞等〔2～5〕。而目前尚未見對于放射性肺損傷的研究。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)被認(rèn)為是與放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子。本實驗研究兒茶素混合體對大鼠急性放射性肺損傷以及肺組織TGF-β表達(dá)的影響和作用。

1 材料與方法

1.1 動物及兒茶素混合品

雌性Wistar大鼠，購自購自廣州省實驗動物中心，體重(200±20)g。供試前在SPF級清潔動物房常規(guī)飼養(yǎng)3 d，觀察無異常者進(jìn)入實驗。兒茶素混合體(EGCG 50% ～60%，EGC 30%，余為ECG和EC)購自廣東省中藥研究所，純度95%以上。

1.2 照射條件

使用美國瓦里安公司的VARIAN 2300C直線加速器(廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣東省中醫(yī)院放療科)產(chǎn)生的6 MV X線。照射時大鼠清醒狀態(tài)俯臥于體模固定板上，用瓦里安直線加速器6 MV X射線等距離照射全肺，照射野上界平大鼠腋窩，下界平胸骨劍突，左、右至胸廓外側(cè)，大鼠全身其余部分用擋鉛屏蔽。源皮距為 100 cm，計算點深度為 2 cm，劑量率為320 cGy/min，一次性照射劑量為15 Gy。

1.3 方法

①實驗大鼠隨機分為4組：對照組10只，兒茶素組10只，照射組10只，兒茶素加照射組10只。兒茶素加照射組動物每日予兒茶素溶于蒸餾水中，100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射，從照射前1 d開始，直至照射后第6天，共腹腔注射7 d;單純兒茶素組以 100 mg·kg－1·d－1予大鼠腹腔注射7 d。實施照射后2 w、6 w，各組動物隨機取5只，處死后分別取肺組織在10%中性甲醛緩沖液中固定準(zhǔn)備制作病理蠟塊。②HE染色光鏡觀察：由病理科醫(yī)生在顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化(盲法)。③肺組織TGF-β蛋白免疫組化染色檢測：一抗為Abcan生物技術(shù)公司兔抗鼠多克隆抗體，抗體工作濃度為8 μg/ml;二抗為福州邁新公司通用試劑盒，按試劑盒說明書操作。每張切片在400倍視野下選取10個有代表性、無重疊、不連續(xù)視野，盲法計數(shù)陽性細(xì)胞，取平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

各組動物TGF-β染色陽性的細(xì)胞數(shù)比較用t檢驗，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀

大鼠肺照射2、6 w后，解剖肉眼可見單純照射組小鼠的肺組織表面明顯點片狀充血、出血病灶;而在照射+兒茶素組的肺組織僅呈充血狀，未見明顯出血病灶。

2.2 組織學(xué)結(jié)果

單照射組大鼠肺損傷較重，包括肺泡內(nèi)出血及肺泡、支氣管上皮、血管的改變，血管周圍水腫均較明顯，特別是在單照射組大鼠由于肺泡出血引起肺實質(zhì)灶性實變和肺泡上皮水腫。而兒茶素+照射組大鼠的肺泡間隔增厚、上皮細(xì)胞的損傷、血管的改變程度都較照射組減輕，見圖1。

2.3 免疫組化

①鏡下觀：空白對照組和單純兒茶素組，在其支氣管上皮中TGF-β呈不均一表達(dá)，在肺實質(zhì)中少量肺泡巨噬細(xì)胞呈陽性表達(dá)，而血管內(nèi)皮和肌層均呈陰性。單純照射組和照射+兒茶素組大鼠，2 w后即可見大量肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞呈陽性表達(dá)，持續(xù)到照射后6 w。②陽性細(xì)胞計數(shù)：空白對照組和單純兒茶素組陽性細(xì)胞數(shù)相對較低，為(16±5)及(21±8)個。照射后2 w單純照射組的陽性細(xì)胞數(shù)為(168±21)個，較上述兩組明顯增高(P＜0.05);照射+兒茶素組的細(xì)胞數(shù)為(74±17)個，顯著低于單純照射組(P＜0.05)。照射后6 w單純照射組的陽性細(xì)胞數(shù)為(133±32)個仍高于照射+兒茶素組的細(xì)胞數(shù)〔(56±18)個，P＜0.05〕。見圖2。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE，×100)

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β表達(dá)(×200)

3 討論

兒茶素具有抗衰老、抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用〔6～8〕。Matuo等〔9〕研究在 EGCG 處理和不處理的情況下用γ射線照射質(zhì)粒DNA，測量pUC118 DNA雙鏈斷裂的數(shù)量，并且測定酵母細(xì)胞照射后突變的頻率，發(fā)現(xiàn)EGCG減少了γ射線導(dǎo)致的DNA損傷，也減少了照射引起的突變。Nair等〔5〕體外研究證實EC對質(zhì)粒pBR322 DNA具有γ射線防護(hù)作用，在體實驗以EC處理大鼠1 h后全身照射γ射線4 Gy，用堿性彗星分析法測定其外周血淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂情況，發(fā)現(xiàn)EC減輕了外周血淋巴細(xì)胞的DNA損傷。Lee等〔4〕研究經(jīng)4種兒茶素單體或混合物處理后，大鼠經(jīng)γ射線照射后的小腸絨毛存活、內(nèi)生脾集落形成、小腸絨毛細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)幾種兒茶素都對實驗動物具有輻射防護(hù)作用，4種單體混合物的放射防護(hù)作用強過任何一種單體。本研究采用兒茶素混合體，各個兒茶素單體對大鼠肺組織急性損傷的防護(hù)情況有待進(jìn)一步研究。

放射性肺損傷，包括早期放射性肺炎和晚期放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放療、骨髓移植預(yù)處理的常見并發(fā)癥，是一個有多種細(xì)胞參與、多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程，當(dāng)肺臟受到照射后，分泌介導(dǎo)放射性肺損傷發(fā)生的細(xì)胞因子，包括TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-4，MCP-1 以及 TGF-β，PDGF，IGF-1，bFGF 等，介導(dǎo)了之后一系列損傷事件發(fā)生，產(chǎn)生病理組織學(xué)改變〔10〕。TGF-β被認(rèn)為是與放射性肺纖維化發(fā)生關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，它不僅促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及分化，而且可誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞參與炎性反應(yīng)。文獻(xiàn)報道，大鼠肺照射后早期即出現(xiàn) TGF-β 的表達(dá)，血清中 TGF-β 升高〔11～13〕。本研究說明下調(diào)了肺組織TGF-β的表達(dá)，起到減輕肺組織急性炎性損傷的作用。

本研究證實兒茶素混合體對大鼠照射肺有一定保護(hù)作用，能夠減輕急性放射性肺損傷，可能是因為其能夠降低組織TGF-β的分泌。在肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中是否有其他細(xì)胞因子分泌的改變尚不清楚，各種兒茶素單體對大鼠肺組織的放射防護(hù)情況也有待進(jìn)一步研究。

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R730.55

〕 A

1005-9202(2012)22-4945-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.042

2009年廣東省科技計劃項目(No.93053)

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院

2 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科

宋維舒(1962-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療學(xué)研究。

石衛(wèi)民(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤放射治療學(xué)研究。

〔2012-04-09收稿 2012-05-18修回〕

(編輯 曲 莉)