王平 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

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MicroRNA研究方法進(jìn)展

王平 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

miRNAs是一類內(nèi)源性、約22個核苷酸長度的非編碼RNA，具有穩(wěn)定的特異性序列以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。2001年，miRNAs作為線蟲生長發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)器而被發(fā)現(xiàn)，在病毒、植物和動物體中，miRNAs已被公認(rèn)為主要的調(diào)控基因家族之一，通過mRNA靶向作用降解或抑制其翻譯。

小RNA在生物進(jìn)化過程中高度保守，并已被證實參與和調(diào)控包括時序發(fā)育、細(xì)胞凋亡脂肪代謝、神經(jīng)元發(fā)育、細(xì)胞分化、激素分泌等在內(nèi)的多種生理過程，以及包括肺癌、白血病在內(nèi)的多種疾病發(fā)生過程[1]。目前，對小RNA表達(dá)的鑒定主要依靠以雜交、PCR、生物芯片的方法；對靶標(biāo)的確定，主要依靠生物信息學(xué)方法；對其功能線索的獲得，則主要依賴于在特定細(xì)胞或動物模型內(nèi)外源性抑制或表達(dá)相應(yīng)的小RNA基因，再通過報告基因系統(tǒng)驗證后檢測特定細(xì)胞或動物模型發(fā)育過程中的生化或分子變化來實現(xiàn)，并同時利用報告基因系統(tǒng)對小RNA的靶基因進(jìn)行驗證。在此筆者對經(jīng)典的及最新發(fā)展的研究小RNA的技術(shù)方法作簡要的總結(jié)和概述。

1 miRNA基因鑒定

1.1 遺傳學(xué)方法

正向遺傳學(xué)的原理是把突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當(dāng)中分離出來，進(jìn)行研究鑒定。而反向遺傳學(xué)則在體外引入特定的突變，然后把已突變的基因放回到原來的宿主當(dāng)中，而且常常是通過同型基因化或換位放回到宿主中原來的位置上，從而觀察表型的改變。在研究miRNAs的時候，反向遺傳學(xué)分析方法常常與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，對可能的miRNAs基因進(jìn)行預(yù)測，然后運用反向遺傳學(xué)分析方法引進(jìn)突變，觀察表型，從而對基因進(jìn)行定位。

1.2 分子生物學(xué)方法

1.2.1 miRNA克隆 不同的小RNA克隆方法的原理基本一致：首先，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離RNA片段，回收20-25 ntRNAs。接著，將篩選的RNA分子，連接到3’和5’的適配子上，逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴(kuò)增，獲得miRNAs 的cDNA文庫，然后對這些cDNA進(jìn)行克隆、測序，再結(jié)合生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。在進(jìn)行miRNAs和適配子連接前通常要進(jìn)行以下處理：miRNA去磷酸化、合成3’適配子時把3’末端羥基與非核苷酸基團(tuán)連接，屏蔽羥基、或者在合成3’適配子時把3’末端在多聚腺苷酸酶的作用下增加poly(A)尾巴[2]。

1.2.2 Northern雜交 PAGE及隨后的Northern雜交，為小RNA檢測提供了簡便而可靠的方法。Northern雜交不僅具有高靈敏的特點，還能結(jié)合使用RNA marker檢測小RNA的分子大小，這對于排除其它小分子RNA的污染有重要意義。Northern雜交也可作為miRNA定量的方法，只需將已知濃度梯度的寡核苷酸對照物與待測樣品進(jìn)行平行雜交即可[3]。

1.2.3 基因芯片(microarray) 對miRNAs表達(dá)水平高通量分析的最普遍的方法是使用寡核苷酸微陣列[4]，在大樣本的研究中，使用這種方法能夠同時測量成百上千miRNAs的基因表達(dá)。另外一種微陣列方法叫作微流引物延伸檢測Microfluidic Primer Extension Assay(MPEA)，這種檢測方法以Febit Geniom?微陣技術(shù)的使用為基礎(chǔ)，miRNA在高度靈敏的微陣列雜交前，不需要標(biāo)記。接著，DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流動芯片的通道中，相應(yīng)的miRNA得以特異延伸。此方法將雜交檢測的特異性與酶延伸的高辨別能力相結(jié)合[5]。

1.2.4 實時定量PCR 與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏地檢測出低豐度表達(dá)的靶分子，并適于高通量篩選。PCR擴(kuò)增簡要過程如下：首先將純化的小分子量RNA與引物混合，經(jīng)變性、復(fù)性過程使引物與模板配對；然后，加入包含逆轉(zhuǎn)錄酶、底物、DTT以及RNA酶抑制劑的混合物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；再以cDNA為模板，進(jìn)行實時定量PCR。

2 miRNA靶標(biāo)鑒定

2.1 計算機(jī)預(yù)測

絕大多數(shù)的miRNAs都是通過堿基配對的方式結(jié)合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū)，從而抑制其翻譯，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。因此靶標(biāo)的鑒定對研究miRNA的功能至關(guān)重要。隨著生物信息學(xué)和計算機(jī)在生物研究應(yīng)用的發(fā)展，很多實驗室都建立了靶標(biāo)鑒定的計算機(jī)方法，計算機(jī)預(yù)測的靶標(biāo)具有可靠性、可驗證性的優(yōu)點。

到目前為止，根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)建立了很多計算機(jī)程序篩選法(附表)。2003年，Stark和同事通過程序?qū)诟构壢蚪M搜尋鑒定潛在的miRNA靶標(biāo)首先得到成功[6]。

附表 已建立的靶標(biāo)預(yù)測方法

MethodType of methodRefsMethod Availa-bilityData Avail-abilityResource http:// Stark et al.Complementarity[7]Online searchYeswww.russell.embl.de/miRNAs/ miRandaComplementarity[8]DownloadYeswww.microrna.org/ miRanda miRBaseComplementarity[9]Online searchYesmicrorna.sanger.ac.uk/ TargetScan Seedcomplementarity[10]Online searchYeswww.targetscan.org/ DIANAThermodynamics[11]Dow-nloadYesdiana.pcbi.upenn.edu/ PicTarThermodynamics[12] Yespictar.bio.nyu.edu/ RNAHy-bridThermodynamics and statistical model[13]Dow-nload bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ miTargetSVMe[14]Online Search cbit.snu.ac.kr/ miTarget/

2.2 miR-TRAP技術(shù)

miR-TRAP技術(shù)是最新發(fā)展的技術(shù)。操作miR-TRAP可分為三個基本步驟，首先通過共軛補骨脂素(一種可通過光激活的植物分子)生成針對目的miRNA的高度光反應(yīng)探針，第二步完成長波紫外線光交聯(lián)反應(yīng)，第三步拉下(pull down)RNA，并用RT-qPCR對其進(jìn)行分析。換句話說，利用紫外線光殺死細(xì)胞，將miRNA/mRNA雙雙冷凍在適當(dāng)?shù)奈恢谩ｋS后從細(xì)胞中抽提出RNA，可以進(jìn)一步檢測結(jié)合mRNA序列，揭示miRNA的靶基因。

3 miRNA功能的研究

3.1 小RNA抑制

目前，主要有兩種方法可以阻斷小RNA的作用：一是敲除小RNA基因或其在靶基因上的結(jié)合位點，二是小RNA的序列特異性抑制。由于分子大小的限制，小RNA基因直接敲除的方法并不實用。所以，研究者多使用反義寡核苷酸抑制劑來阻斷小RNA的作用[15-17]。這種抑制劑是體外化學(xué)合成，能與特異性小RNA完全互補的反義RNA。在借助轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入目的細(xì)胞后，能快速并穩(wěn)定地與內(nèi)源性成熟小RNA分子互補結(jié)合，從而阻止了內(nèi)源性小RNA分子與靶基因配對。

3.2 小RNA的過表達(dá)

與常規(guī)mRNA的功能研究相似，小RNA的過表達(dá)研究也是研究小RNA功能的一種主要方式。可以通過構(gòu)建小RNA表達(dá)載體，或體外直接合成小RNA前體，轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞兩種方式來實現(xiàn)。前者由于可獲得穩(wěn)定的過表達(dá)細(xì)胞株而應(yīng)用較為普遍。在前一種方式中，通常先從基因組中擴(kuò)增小RNA基因及其旁側(cè)序列，然后將其克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體，最后感染目的細(xì)胞觀察功能效應(yīng)[18,19]

3.3 小RNA的報告基因系統(tǒng)

小RNA的報告基因系統(tǒng)，是小RNA研究中一種常用的輔助手段，它常被用于檢測單個小RNA的抑制情況及驗證小RNA的靶基因。當(dāng)使用序列特異的抑制劑抑制細(xì)胞內(nèi)的特異小RNA時，常同時轉(zhuǎn)入3′UTR區(qū)含有該小RNA互補序列的報告基因載體，來驗證小RNA的作用是否被阻斷[20]。同樣，為了驗證預(yù)測的靶基因是否被小RNA所抑制，可將預(yù)測靶基因的小RNA互補位點或3′UTR序列克隆入報告基因序列的下游，然后通過分析報告基因的表達(dá)情況，來驗證靶基因預(yù)測的正確與否[21,22]。

4 前景和展望

自從第一個miRNA被發(fā)現(xiàn)以來，此類非編碼小RNA成為研究的熱點。短短幾年，miRNA的研究從發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識miRNA分子到了解其功能和作用機(jī)制。近年來對miRNA的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，并且有大量的miRNA被鑒定，許多實驗室都開發(fā)了miRNA基因鑒定，靶標(biāo)鑒定計算機(jī)鑒定方法。miRNA微芯片技術(shù)可以作為實現(xiàn)高通量檢測的手段，但必須有大量的已知miRNA作為基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析技術(shù)是高通量研究miRNA的有效手段，但是結(jié)果具有不確定性，需要常規(guī)分子生物學(xué)方法做輔助驗證。在實際研究中將常規(guī)分子生物學(xué)方法和生物信息學(xué)分析技術(shù)聯(lián)合使用，發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢。為預(yù)測更多miRNA，并鑒定其靶標(biāo)，確定其功能，需要我們把生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)以及遺傳學(xué)等學(xué)科的研究方法結(jié)合起來。

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（2012–09–05）

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1007-1733(2012)12-0084-03