陶新萍 （山東省昌樂縣紅河鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 262411） 劉恩昌 （山東省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局）

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雞大腸桿菌區(qū)域性實時藥敏動態(tài)檢測

陶新萍 （山東省昌樂縣紅河鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 262411） 劉恩昌 （山東省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局）

本試驗采集了泰安及周邊地區(qū)疑似大腸桿菌病、死雞的肝臟、心臟等樣品63份，按照不同時間段將其分成3組。經(jīng)過細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗鑒定證明均為致病性大腸桿菌。按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS)的判定標(biāo)準(zhǔn)，對分離得到的63株大腸桿菌對12種常用抗生素進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明，63株病菌對常用抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，耐藥范圍較廣，不同菌株間存有較大差異，但該地區(qū)大多數(shù)菌株對克林沙星、丁胺卡那霉素高敏，而磷霉素鈉和頭孢噻肟產(chǎn)生了廣泛耐藥性。不同時間段分離菌的耐藥結(jié)果變化不大。

大腸桿菌病 流行病學(xué)調(diào)查 藥敏試驗 耐藥性

埃希菌(Escherichia coli)俗稱大腸桿菌(E.coli)，是埃希氏菌屬中最重要的一種細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，一些特殊血清型的大腸桿菌對動物有致病性[1]，如某些致病性大腸桿菌能引起禽嚴(yán)重腹瀉、蜂窩織炎、腫頭綜合征、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍帶炎、眼炎、纖維蛋白性心包炎和敗血癥等，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。近30年來，隨著我國規(guī)?；B(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展，禽大腸桿菌性疾病的危害越來越重，雞大腸桿菌已成為最嚴(yán)重的病原菌之一[3]，尤其是近年來抗生素在養(yǎng)雞業(yè)的無節(jié)制、不規(guī)范的大量應(yīng)用，多重耐藥菌株廣為流行，使雞大腸桿菌病防不勝防。為有效防治某密集養(yǎng)殖地區(qū)的雞大腸桿菌病，特進(jìn)行了雞大腸桿菌區(qū)域性實時藥敏動態(tài)檢測及高效藥物研發(fā)的研究。

腸桿菌的耐藥率大幅度上升，多重耐藥菌株劇增，耐藥譜增寬。對硫酸新霉素、氯霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、麥迪霉素、吡哌酸的耐藥率最高；對慶大霉素、卡那霉素有中等敏感性；對呋喃妥因、多粘菌素B的耐藥性最低。近年來，微生物對大多數(shù)喹諾酮類藥物的耐藥率達(dá)10%以上，我國部分地區(qū)耐藥大腸桿菌比率高達(dá)40%以上。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 培養(yǎng)皿，電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋，試管，恒溫箱，冰箱，剪刀，接種環(huán)，酒精燈，無菌操作臺等。

1.1.2 試劑 藥敏試紙片(丁安卡那霉素、硫酸新霉素、鹽酸克林沙星、左旋氧氟沙星、乳酸恩諾、氟苯尼考、粘桿菌素、磷霉素納、頭孢哌舒、頭孢曲松、頭孢噻肟、阿莫西林)、麥康凱培養(yǎng)基、葡萄糖、乳糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、V-P試驗、普通瓊脂、革蘭氏染色液等。

1.1.3 病料 2012年4~6月自泰安及周邊地區(qū)獸醫(yī)門診63例病死雞和病殘雞的肝臟和心臟分離病菌。

1.2 方法

1.2.1 麥康凱培養(yǎng)基的制備 稱取52.00g麥康凱培養(yǎng)基倒入錐形瓶中，加800ml去離子水,用電爐微熱,玻棒攪拌,使其完全溶解,最后定容至1000ml。將錐形瓶及培養(yǎng)皿洗好、晾干的培養(yǎng)皿包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行高壓滅菌15min。滅菌后,倒入平皿(厚度3mm),冷卻后,倒置,放入4℃冰箱備用[4]。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病、瀕死雞的肝臟接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，放于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

1.2.3 細(xì)菌染色、鏡檢 無菌從肝臟或心臟取病料直接涂片，染色(草酸銨結(jié)晶紫1~2min，水洗；革蘭氏碘液媒染1~3min，水洗；95%~96%酒精脫色20~30s，1min水洗；加稀釋復(fù)紅染10~30s，水洗；吸干)，顯微鏡觀察。

1.2.4 生化試驗 將純化菌株分別接種于葡萄糖、甘露醇、靛基質(zhì)等生化鑒定管中，放于37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。

1.2.5 藥敏試驗 將收集大腸桿菌按時間分為3組：4.7~4.26為第1組26株，4.27~5.16為第2組21株，5.17~6.7為第3組16株。

無菌操作勾取大腸桿菌純培養(yǎng)菌落以劃線方式致密而均勻地涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基表面。再用無菌尖頭鑷子攝取各種抗菌素藥敏試紙片，按一定密度分別貼到上述己涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基表面。將貼好藥敏試紙片的平板翻轉(zhuǎn)，底部向上，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h，取出觀察結(jié)果，并測定抑菌圈直徑，作好記錄。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)

在麥康凱培養(yǎng)基上生長成光滑濕潤粉紅色圓形菌落；在普通平板培養(yǎng)基上生長成突起、濕潤乳白色圓形菌落。所分離的細(xì)菌均為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短小桿菌。

2.2 生化結(jié)果

所分離的細(xì)菌均能分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗、靛基質(zhì)試驗均為陽性，V.P均為陰性，均不能利用檸檬酸鹽，均能在三糖鐵培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

2.3 藥敏試驗

判定標(biāo)準(zhǔn)按抑菌圈直徑大小作為敏感性高低的標(biāo)準(zhǔn)。抑菌圈直徑越大表明細(xì)菌對該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑大于20.1mm的為高度敏感；直徑在15.1~ 20.0mm者為中度敏感；直徑在6.0~15.0mm者為低度敏感或耐藥[5]。

2.3.1 第1組 對克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、頭孢曲松、頭孢哌舒、硫酸新霉素高度敏感的大腸桿菌也較多，粘桿菌素、左旋氧氟沙星中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較強(qiáng)。

2.3.2 第2組 對克林沙星、丁胺卡那霉素、頭孢曲松高度敏感，粘桿菌素、左旋氧氟沙星、頭孢哌舒、氟苯尼考中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較強(qiáng)。

2.3.3 第3組 對克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、左旋氧氟沙星、硫酸新霉素高度敏感的大腸桿菌也較多，粘桿菌素、阿莫西林、頭孢曲松中度敏感，而對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾、氟苯尼考耐藥性較強(qiáng)。

3 討論

表1表明大腸桿菌對克林沙星高度敏感，敏感率達(dá)60.32%，對丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、頭孢曲松高度敏感率較高，分別是41.27%、28.57%、34.92%。對粘桿菌素、左旋氧氟沙星中度敏感分別是52.38%、31.75%。大腸桿菌對克林沙星最敏感為79.37%，對丁胺卡那霉素、頭孢曲松、粘桿菌素、硫酸新霉素也敏感，對頭孢噻肟、磷霉素鈉、乳酸恩諾耐藥性較高，藥物敏感率為9.53%、6.35%。

表1 泰安及周邊地區(qū)大腸桿菌分離菌藥物敏感率 (%)

對比發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對藥物的敏感性在不斷地變化，但是大部分的藥物敏感性變化不大，克林沙星對大腸桿菌一直保持高度敏感，而硫酸新霉素、頭孢曲松、左旋氧氟沙星則敏感性變化較大，對磷霉素鈉、頭孢噻肟耐藥性較高。因此，及時實時動態(tài)檢測大腸桿菌對藥物敏感性，有利于研發(fā)高效抗菌藥物，對治療和預(yù)防大腸桿菌具有重要的實踐意義。

[1] 胡仕鳳, 雷紅宇, 寧玲忠. 雞大腸埃希菌病的診斷與防治[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治, 2005. 5-15.

[2] 周霞, 王靜梅, 馬貴軍. 雞大腸埃希菌的分離鑒定及免疫預(yù)防[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2005. 42-43.

[3] 陳溥言主編. 獸醫(yī)傳染病學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2008.

[4] 陳天壽主編. 微生物培養(yǎng)基的制備與應(yīng)用[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995.

[5] 姚火春主編. 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

（2012–07–12）

S852.61+2

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1007-1733(2012)12-0013-02