李 蕾,韓菲菲,王發(fā)龍,劉 潔,陳國(guó)千*
(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,江蘇 無錫214023;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院 呼吸科)
氧是人體各種細(xì)胞維持正常代謝活動(dòng)所必需的。免疫細(xì)胞在人體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用,且常處于病理性或生理性缺氧環(huán)境中。在諸多病理情況下,如感染、炎癥、創(chuàng)傷、休克、腫瘤、器官移植等,常發(fā)生缺氧[1]。缺氧可以明顯影響免疫細(xì)胞的多種生物學(xué)功能,如基因表達(dá)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、凋亡、能量代謝等。缺氧能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等炎癥介質(zhì)的釋放。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)為近年發(fā)現(xiàn)的一種重要晚期炎癥介質(zhì),與膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、急性胰腺炎、肺炎、腫瘤、缺血再灌注損傷、燙傷等發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切[2]。許多研究顯示,巨噬細(xì)胞受脂多糖、TNF、生物活性脂等誘導(dǎo)后,胞內(nèi)HMGB1可主動(dòng)分泌到細(xì)胞外[3,4],但缺氧是否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放HMGB1尚未見研究報(bào)道。
巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫,缺氧培養(yǎng)箱為長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司生產(chǎn)的YCP-50S三氣培養(yǎng)箱,使用99.99%N2。RPMI-1640、OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,N-乙酰半胱氨酸(NAC)、臺(tái)盼藍(lán)為Sigma公司產(chǎn)品,兔抗 HMGB1多克隆抗體為Gene Tex公司產(chǎn)品,熒光素FITC標(biāo)記羊抗兔IgG為北京博奧森公司產(chǎn)品,RNAiso Plus、Prime Script RT Master Mix、Prime Ex Taq為Takara公司產(chǎn)品。
巨噬細(xì)胞株RAW264.7使用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉 素、2mmol/L 谷氨 酰 胺)在37℃、5%CO2、95%空氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞貼壁覆蓋80%-90%時(shí),換用無血清OPTI-MEM I培養(yǎng)液并洗滌2次,隨后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組繼續(xù)置于37℃、5%CO2、95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),缺氧組置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)氣體設(shè)置為5%CO2、1%O2、94%N2。細(xì)胞培養(yǎng)液收集后離心取上清液檢測(cè)HMGB1含量。各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。通過臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞染色顯示,巨噬細(xì)胞株RAW264.7經(jīng)缺氧培養(yǎng)24h或100mmol/L NAC作用后細(xì)胞存活率無明顯改變。
細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。HMGB1ELISA試劑盒為日本Shino-Test公司產(chǎn)品,按產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行分析定量。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。根據(jù)Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)總體系10μl,反應(yīng)條件37℃15min,85℃5sec,cDNA產(chǎn)物置-20℃保存。HMGB1、GAPDH引物和探針由Takara公司合成,見表1。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性30sec,95℃變性5sec,56℃退火15sec,72℃延伸20sec,循環(huán)40次。以HMGB1和GAPDH的Ct值之差(△Ct)作為HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)水平的指標(biāo)。
表1 HMGB1、GAPDH的引物及探針序列
培養(yǎng)巨噬細(xì)胞以4%甲醛固定10min,0.3%Triton X-100(pH 7.4)處理15min,10%牛血清白蛋白室溫封閉1h,然后分別與兔抗HMGB1多克隆抗體和FITC標(biāo)記羊抗兔IgG37℃孵育1h,加甘油緩沖液、封片,以熒光顯微鏡觀察。
使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包,兩組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
巨噬細(xì)胞株RAW264.7經(jīng)缺氧(1%O2)培養(yǎng)12h、24h后,培養(yǎng)上清液中HMGB1含量明顯升高(P<0.01),分別為對(duì)照組的4.0和5.4倍,見表2。
表2 缺氧對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的影響(μg/L,±s)
表2 缺氧對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1含量的影響(μg/L,±s)
注:與對(duì)照組比較,*P<0.01;各組各時(shí)間點(diǎn)n=62.
細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間6h 12h 24h對(duì)照組組別1.34±0.47 2.66±0.50 4.27±1.16缺氧組 1.90±0.51 10.75±1.99* 23.15±3.79*
巨噬細(xì)胞株RAW264.7經(jīng)缺氧(1%O2)培養(yǎng)6 h、12h和24h后,細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)(P<0.01),且均明顯高于各自對(duì)照組(P<0.05或P<0.01),見表3。
表3 缺氧對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)的影響(△Ct,±s)
表3 缺氧對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞HMGB1mRNA表達(dá)的影響(△Ct,±s)
注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;各組各時(shí)間點(diǎn)n=6
6h 12h 24h對(duì)照組組別5.92±0.35 5.79±0.41 6.02±0.30缺氧組 5.34±0.47* 4.20±0.28** 2.91±0.18**
HMGB1細(xì)胞免疫熒光染色顯示,對(duì)照組(普通培養(yǎng))HMGB1主要定位于細(xì)胞核,而缺氧培養(yǎng)12h后,細(xì)胞核HMGBl特異性染色明顯變淡,胞漿染色加深,見圖1。
圖1 RAW264.7巨噬細(xì)胞HMGB1免疫熒光染色
10mmol/L和100mmol/L的NAC對(duì)巨噬細(xì)胞株RAW264.7缺氧培養(yǎng)24h后培養(yǎng)上清液中的HMGB1含量顯示明顯抑制作用(P<0.01),且100 mmol/L NAC的抑制作用明顯強(qiáng)于10mmol/L NAC(P<0.05),呈劑量依賴性,但0.1mmol/L和1mmol/L NAC的抑制作用不明顯(P>0.05),見圖2。
圖2 NAC對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞缺氧釋放HMGB1的影響
高遷移率族蛋白(HMG)為一類核內(nèi)非組蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名。HMG包括 HMGA、HMGB、HMGN 3個(gè)家族,而HMGB家族有3個(gè)成員即 HMGB1、HMGB2、HMGB3。HMGB1在哺乳動(dòng)物中高度保守,其氨基酸序列同源性在人和嚙齒類動(dòng)物間高達(dá)99%。HMGB1由215個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為30×103。HMGB1最初被認(rèn)為是染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分,功能局限在核內(nèi),主要參與穩(wěn)定核小體的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA修復(fù)、DNA重組及調(diào)控類固醇激素等生命活動(dòng)。1999年,Wang等[3]發(fā)現(xiàn)HMGB1可以釋放到胞外并介導(dǎo)炎癥反應(yīng),為內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的重要炎癥介質(zhì)。
HMGB1可以在細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)、脂多糖及生物活性脂等因素刺激下,由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等主動(dòng)分泌;也可由壞死細(xì)胞或受損細(xì)胞被動(dòng)釋放。諸多研究[2]表明,炎癥介質(zhì)HMGB1參與許多疾病的病理過程,如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、腫瘤、缺血再灌注損傷、燙傷等。
缺氧可以明顯影響免疫細(xì)胞的多種生物學(xué)功能如炎癥反應(yīng)等。研究[5]顯示,缺氧可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1等多種細(xì)胞因子或生物活性介質(zhì),參與炎癥反應(yīng)。Acosta-Iborra等[6]報(bào)道,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)可以產(chǎn)生高水平的IFN-γ、IL-12mRNA 及其蛋白表達(dá),而抗炎性細(xì)胞因子IL-10mRNA水平保持不變;Thobe 等[7]報(bào)道,缺氧可致枯否(Kupffer)細(xì)胞IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的生成釋放增加,其IL-6增加機(jī)制與通過Src介導(dǎo)的p38MAPK活化有關(guān)。近年有個(gè)別報(bào)道[8,9]顯示,缺氧(1%O2)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放HMGB1,且為非死亡被動(dòng)釋放,呈時(shí)間依賴性,24h達(dá)到高峰;分離的新生心細(xì)胞在缺氧(1.5%O2)培養(yǎng)下合成和釋放HMGB1增加,12h達(dá)到高峰,而在常氧(21%O2)下培養(yǎng)至24h,HMGB1表達(dá)仍無明顯的變化。缺氧對(duì)巨噬細(xì)胞HMGB1釋放的誘導(dǎo)作用尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以缺氧作為刺激因素,研究其對(duì)巨噬細(xì)胞HMGB1釋放的影響。臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)顯示缺氧24h以內(nèi)對(duì)細(xì)胞生存率無明顯影響,各組細(xì)胞存活率均在95%以上,因而排除了細(xì)胞壞死發(fā)生的HMGBl被動(dòng)釋放。本研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞株RAW264.7經(jīng)缺氧誘導(dǎo)12h后培養(yǎng)上清液HMGB1蛋白水平明顯升高,24h后釋放達(dá)到高峰,細(xì)胞免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)HMGBl出現(xiàn)核漿轉(zhuǎn)移。因蛋白質(zhì)的表達(dá)受多級(jí)水平的調(diào)控,如轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平調(diào)控等,所以我們同時(shí)測(cè)定了HMGB1mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,缺氧6h時(shí)HMGB1mRNA表達(dá)已顯示增強(qiáng),表明缺氧誘導(dǎo)HMGB1分泌增加與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控有關(guān)。
有研究顯示,將細(xì)胞置于缺氧環(huán)境中數(shù)小時(shí)后,通過二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)熒光標(biāo)記法測(cè)定的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)含量增加[10]。NAC作為一種巰基供給體,具有清除自由基、抗氧化劑等作用,本研究使用NAC進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示10、100mmol/L的NAC對(duì)缺氧誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞HMGB1釋放具有明顯的抑制作用,與Tsung等[8]使用肝細(xì)胞的研究結(jié)果基本一致,提示缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞HMGB1釋放可能與胞內(nèi)ROS產(chǎn)生有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)HMGB1釋放是否涉及其它氧依賴相關(guān)信號(hào)通路等還有待進(jìn)一步研究。
[1]Eltzschig HK,Carmeliet P.Hypoxia and inflammation[J].N Engl J Med,2011,364(7):656.
[2]Sims GP,Rowe DC,Rietdijk ST,et al.HMGB1and RAGE in inflammation and cancer[J].Annu Rev Immunol,2010,28:367.
[3]Wang H,Bloom O,Zhang M,et al.HMG-1as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J].Science,1999,285(5425):248.
[4]Chen G,Li J,Ochani M,et al.Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1partly through CD14-and TNF-dependent mechanisms[J].J Leukoc Biol,2004,76(5):994.
[5]Dziurla R,Gaber T,F(xiàn)angradt M,et al.Effects of hypoxia and/or lack of glucose on cellular energy metabolism and cytokine pro-duction in stimulated human CD4+ T lymphocytes[J].Immunol Lett,2010,131(1):97.
[6]Acosta-Iborra B,Elorza A,Olazabal IM,et al.Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1alpha transcription factor[J].J Immunol,2009,182(5):3155.
[7]Thobe BM,F(xiàn)rink M,Choudhry MA,et al.Src family kinases regulate p38MAPK-mediated IL-6production in Kupffer cells following hypoxia[J].Am J Physiol Cell Physiol,2006,291(3):C476.
[8]Tsung A,Klune JR,Zhang X,et al.HMGB1release induced by liver ischemia involves Toll-like receptor 4dependent reactive oxygen species production and calcium-mediated signaling[J].J Exp Med,2007,204(12):2913.
[9]Andrassy M,Volz HC,Igwe JC,et al.High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart[J].Circulation,2008,117(25):3216.
[10]Kietzmann T,G?rlach A.Reactive oxygen species in the control of hypoxia-inducible factor-mediated gene expression[J].Semin Cell Dev Biol,2005,16(4-5):474.
中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)2012年5期