何金婷，莽 靖，郭洪亮，梅春麗，胥桂華，陳 罕，徐忠信

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033）

本實(shí)驗(yàn)采用PC12細(xì)胞是由大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分離并建立起的細(xì)胞系，其在體外經(jīng)NGF刺激誘導(dǎo)后可向交感神經(jīng)元分化，最終導(dǎo)致PC12細(xì)胞在生理、生化方面具有神經(jīng)元樣的功能，同時(shí)應(yīng)用體外氧糖剝奪（oxygen－glucose deprivation，OGD）來(lái)模擬體內(nèi)腦缺血過(guò)程，為探討缺血缺氧狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元的活力、凋亡、信號(hào)通路機(jī)制的研究定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠PC12細(xì)胞株購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代 將細(xì)胞懸液加入含有DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)液2－3天更換一次。當(dāng)細(xì)胞匯集至80%時(shí)進(jìn)行傳代接種。

1.2.2 鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞PC12細(xì)胞培養(yǎng)1－2天，觀察細(xì)胞貼壁后，用含NGF終濃度為50ng／ml的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定PC－12細(xì)胞分別在NGF培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，用NSE免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，顯微鏡下觀察，以在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者判定為陽(yáng)性，每張爬片隨機(jī)選取3個(gè)100×視野，計(jì)數(shù)，取均值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，其中突起的長(zhǎng)度超過(guò)胞體直徑2倍者計(jì)為陽(yáng)性，每次至少計(jì)數(shù)3個(gè)孔取平均值。

1.2.4 PC－12細(xì)胞 OGD 模型的建立 PC12細(xì)胞培養(yǎng)48h后，用缺氧缺糖DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，用該液體孵育細(xì)胞，將培養(yǎng)板快速放入已造成缺氧環(huán)境的缺氧罐中，夾閉進(jìn)氣口和出氣口；將缺氧罐放入37℃孵箱內(nèi)開始計(jì)時(shí)，根據(jù)3、6、9、12、16、24 h將細(xì)胞隨機(jī)分為6組進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5 PC－12細(xì)胞氧糖剝奪模型評(píng)價(jià) MTT法細(xì)胞存活率檢測(cè) 在OGD不同時(shí)間組及對(duì)照組每孔加入10μl MTT溶液，后4h，每孔加入100μl二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率。AO／EB熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞爬片后，將PC－12細(xì)胞依據(jù)不同的時(shí)間點(diǎn)行OGD處理后，取出細(xì)胞爬片，固定，滴加AO／EB混合液10－15μl，應(yīng)用熒光顯微鏡下記錄攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)

初次復(fù)蘇PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)，胞體圓形，處于游離期細(xì)胞貼壁能力較差，易聚集成團(tuán)，呈半懸浮狀態(tài)；培養(yǎng)24h后細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)并分裂增殖，吸附期PC12細(xì)胞在培養(yǎng)基中多呈橢圓或多角形，傾向于聚集成團(tuán)簇狀；培養(yǎng)約72h后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞折光性強(qiáng)，數(shù)目明顯增多。

2.2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)

PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元樣細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，細(xì)胞長(zhǎng)出突觸增粗增長(zhǎng)，貼壁牢固；培養(yǎng)7d后基本無(wú)法消化傳代；培養(yǎng)10d后細(xì)胞進(jìn)入衰退期。

形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)24h可見細(xì)胞長(zhǎng)出較短、較細(xì)的突觸；48h突觸數(shù)量及長(zhǎng)度增加；72h突觸長(zhǎng)度可達(dá)胞體的4－5倍，交織成網(wǎng)狀，呈典型的神經(jīng)元形態(tài)，占總數(shù)96%以上。

NSE免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 藍(lán)色激發(fā)光下可見散在分布、呈星形并帶有較長(zhǎng)突起的綠色熒光區(qū)域，與背景對(duì)比明顯；紫色激發(fā)光下，可見復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；圖像融合后證實(shí)綠色熒光區(qū)域?yàn)镻C12細(xì)胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細(xì)胞，NSE免疫熒光染色呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

2.3 PC－12細(xì)胞氧糖剝奪（OGD）模型建立與評(píng)價(jià)

2.3.1 氧糖剝奪不同時(shí)間MTT法細(xì)胞存活率檢測(cè)

OGD3h細(xì)胞存活率較對(duì)照組略有降低，但無(wú)顯著差異，隨OGD時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，OGD12h后下降更為明顯，OGD24h細(xì)胞存活率降至9.08%，與對(duì)照組和OGD3h組比較差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1 OGD不同時(shí)間PC12細(xì)胞存活率MTT檢測(cè)

2.3.2 AO／EB熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 正常對(duì)照組細(xì)胞核呈綠色熒光，見極少量的橙紅色熒光，核呈較規(guī)整橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，未見明顯凋亡細(xì)胞；OGD3h、6h橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組略有所增加；隨OGD時(shí)程延長(zhǎng)，橙紅色熒光細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增加，可見少數(shù)核形態(tài)不規(guī)則凋亡細(xì)胞；OGD16h橙紅色熒光死亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，綠色熒光細(xì)胞數(shù)量稀少；OGD 24h細(xì)胞多數(shù)死亡，可見核碎裂、固縮呈橙紅色熒光，見表2。

表2 OGD不同時(shí)間AO／EB雙染細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

3 討論

在缺血性腦損傷研究中，由于體內(nèi)環(huán)境較為復(fù)雜，而在相對(duì)單一的體外培養(yǎng)系統(tǒng)因可以對(duì)研究條件和研究對(duì)象進(jìn)行人為控制，并可避免體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響。因神經(jīng)元是不可再生細(xì)胞，神經(jīng)元原代培養(yǎng)難度較大，最終可用于實(shí)驗(yàn)的數(shù)量、純度均受到一定限制。本研究于體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，應(yīng)用NGF刺激誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，用于神經(jīng)元氧糖剝奪模型建立。結(jié)果顯示PC12細(xì)胞經(jīng)NGF刺激轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元樣細(xì)胞具有典型的神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞不再增殖分裂，具有神經(jīng)元特性［1］。經(jīng)特異性烯醇化酶（Neurospecific enolase，NSE）免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，見NSE陽(yáng)性神經(jīng)元胞漿及突觸呈綠色熒光，核呈藍(lán)色熒光證實(shí)為神經(jīng)元樣細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

腦缺血模型報(bào)道較多［2，3］，為研究機(jī)體內(nèi)的急性缺血性腦損傷機(jī)制，常通過(guò)建立體外神經(jīng)細(xì)胞的OGD模型，來(lái)模擬機(jī)體缺血性腦損傷過(guò)程［4－6］。在體外建立可模擬機(jī)體急性缺血性腦損傷的神經(jīng)元OGD模型，本研究在建立PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)化神經(jīng)元OGD模型的基礎(chǔ)上，在 OGD3、6、9、12、16、24h應(yīng)用MTT法對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示隨OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸由97.23%下降至9.08%（P＜0.05），提示模型建立成功，但 MTT法是以最終溶液OD值間接計(jì)算存活率，難以反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。因此，實(shí)驗(yàn)同時(shí)應(yīng)用細(xì)胞爬片法應(yīng)用AO／EB雙染對(duì)細(xì)胞原位凋亡進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OGD12h之前，雖細(xì)胞凋亡率逐漸升高，但變化并不明顯；OGD12h細(xì)胞凋亡率迅速升高至較高水平，說(shuō)明細(xì)胞自身有對(duì)抗缺血缺氧的能力，但不能維持較長(zhǎng)時(shí)間，這也印證在大腦皮層細(xì)胞在急性缺血時(shí)存在缺血半暗帶，在當(dāng)能量?jī)?chǔ)備和無(wú)氧酵解能力已趨耗竭時(shí)，細(xì)胞也將逐漸趨向凋亡和死亡。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的氧糖剝奪方法可明顯造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，成功模擬體內(nèi)腦缺血過(guò)程，為研究神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷提供有效、簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠的方法和手段。

［1］Greene LA，Tischler AS.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1976，73 （7）：2424.

［2］158.Glazier SS，O′Rourke DM，Graham DI，et al.Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1994，14：545.

［3］161.Sugawara T，Noshita N，Lewen A，et al.Neuronal expression of the DNA repair protein KU 70after ischemia preconditioning corresponds to tolerance toglobal cerebral ischemia［J］.Stroke，2001，32（10）：2388.

［4］Jones PA，May GR，McLuckie JA，et al.Apoptosis is not an invariable component of in vitro models of cortical cerebral ischaemia.Cell Res.2004；14（3）：241－50.PMID：15225418.

［5］Kaushal V，Schlichter LC.Mechanisms of microglia－mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra［J］.J Neurosci，2008，28（9）：2221.

［6］Dugan LL，Kim－Han JS.Astrocyte mitochondria in in vitro models of ischemia［J］.J Bioenerg Biomembr，2004，36（4）：317.