王維剛，王志剛，李大鵬

（吉林醫(yī)藥學(xué)院 附屬465醫(yī)院，吉林 吉林132013）

骨肽具有調(diào)節(jié)骨代謝、刺激成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)新骨形成等藥理作用，多用于骨折和骨折手術(shù)愈合及風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療［1］。堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OC）是成骨細(xì)胞分泌的兩種非膠原成分?；钚猿晒羌?xì)胞在早期發(fā)育階段細(xì)胞內(nèi)就富含ALP，后期成熟階段成骨細(xì)胞可產(chǎn)生和分泌骨鈣素［2］，因此ALP和OC不僅是成骨細(xì)胞生長和發(fā)育早期和晚期的表型標(biāo)志，同時(shí)是成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)的體現(xiàn)，是骨形成指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)研究骨肽對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞中ALP和OC表達(dá)的影響，探討骨肽在成骨細(xì)胞成骨功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD乳鼠購自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑 DMEM－H培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；骨肽（黑龍江江世藥業(yè)有限公司）OC放射免疫試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 顱蓋骨分離成骨細(xì)胞 取1－3d齡小鼠乳鼠20只，無菌條件下取出顱蓋骨，PBS液清洗，置入含有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪成碎塊，0.25%胰蛋白酶中消化30min，37℃；血清終止消化，1.0g／LⅠ型膠原酶消化1h，37℃，2次，冷PBS終止消化，吸取上清液，1 000r／min離心8min，培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞，以1×106密度將細(xì)胞懸液種植于10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3.2 骨肽對成骨細(xì)胞作用 骨肽按照濃度分為0.002mg／ml、0.008mg／ml、0.032mg／ml分為三個(gè)劑量，對照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別在1d、3d、5 d利用生化法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP的含量。骨肽不同劑量繼續(xù)作用后10d和15d，利用ELISA試劑盒檢測OC含量。

2 結(jié)果

與對照組相比（見表1），骨肽濃度為0.002mg／ml時(shí)，細(xì)胞上清中ALP含量無明顯改變。隨著骨肽濃度增高，ALP的含量有增高的趨勢，0.008mg／ml組各時(shí)間點(diǎn)與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；0.032mg／ml劑量組各時(shí)間點(diǎn)與對照組相比時(shí)ALP增高更加明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P＜0.01）。在10d與15d時(shí)間點(diǎn)檢測OC含量發(fā)現(xiàn)（見表2），與對照組相比0.002mg／ml時(shí)，OC含量無明顯改變。0.008mg／ml劑量組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)OC含量與對照組相比有顯著增加（P＜0.05）；0.032mg／ml劑量組與對照組相比OC含量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性增高，尤其是10d時(shí)差異明顯（P＜0.01）。

表1 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對成骨細(xì)胞ALP含量的影響（±s）

表1 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對成骨細(xì)胞ALP含量的影響（±s）

＊與對照組相比P＜0.05，ΔP＜0.01

骨肽（mg／ml）ALP in osteoblasts（t／d）1 3 5對照組0.17±0.02 0.18±0.01 0.19±0.02 0.002 0.22±0.01 0.21±0.04 0.21±0.05 0.008 0.38±0.02＊ 0.37±0.03＊ 0.35±0.05＊0.032 0.45±0.02Δ 0.43±0.02Δ 0.43±0.03Δ

表2 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對成骨細(xì)胞OC含量的影響（±s）

表2 不同劑量、不同時(shí)間骨肽對成骨細(xì)胞OC含量的影響（±s）

＊與對照組相比P＜0.05，ΔP＜0.01

0.002 0.008 0.032 10d 1.12±0.02 1.37±0.01 1.63±0.02＊ 1.71±0.02對照組 骨肽濃度（mg／ml）Δ 15d 1.08±0.01 1.27±0.04 1.44±0.05＊ 1.57±0.03＊

3 討論

成骨細(xì)胞是維持骨重建的主要細(xì)胞，它來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，功能是分泌骨基質(zhì)，是骨形成過程中重要的功能細(xì)胞。在骨折愈合和骨缺損性疾病中，動(dòng)員成骨細(xì)胞成骨功能，產(chǎn)生骨基質(zhì)是治療的關(guān)鍵［3－5］。

骨肽是從中經(jīng)高科技生物技術(shù)精制提取的一種新型骨病治療藥物，內(nèi)含有多種與骨代謝有關(guān)的生長因子及鈣、磷等元素，具有廣泛的生物學(xué)活性，在體內(nèi)可參與骨鈣的吸收和釋放，調(diào)節(jié)骨代謝的平衡，促進(jìn)骨痂和新血管的形成，因此在臨床上廣泛應(yīng)用于骨折和骨折疏松的治療。

本實(shí)驗(yàn)利用骨肽作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，系統(tǒng)研究了不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)兩種關(guān)鍵的骨形成指標(biāo)ALP和OC含量的變化，首次研究了骨肽成骨功能的作用特點(diǎn)。結(jié)果顯示：骨肽濃度在0.002 mg／ml時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)ALP含量變化不明顯，考慮與骨肽濃度過低無法啟動(dòng)成骨分化有關(guān)。0.008mg／ml和0.032mg／ml兩個(gè)劑量組，ALP含量表達(dá)增高，而且存在劑量依賴關(guān)系，證實(shí)骨肽濃度達(dá)到一定作用水平時(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌ALP。同時(shí)10 d與15d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在0.008mg／ml和0.032 mg／ml兩個(gè)劑量組OC明顯增高，也存在劑量依賴關(guān)系。雖然15d組在兩個(gè)濃度劑量OC含量與10 d組相比有下降的趨勢，考慮可能與在10d時(shí)已經(jīng)產(chǎn)生足夠多的OC，而單純的依靠時(shí)間延長已經(jīng)無法促進(jìn)OC的產(chǎn)生，有關(guān)這部分的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

總之，骨肽能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生ALP和OC，以中高劑量組促進(jìn)成骨能力較為顯著。

［1］鄧?yán)辏?雪，范慧紅.骨肽及復(fù)方骨肽注射液降壓物質(zhì)的研究［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（4）231.

［2］Murray J，F(xiàn)avus MD.Primer on the metabolic bone disease and disorders of mineral metabolism ［M］.4th ed.Philadelphia（USA）：Lippincott Williams ＆ Wilkins，1999.16－18.

［3］Caetano－Lopes J，Canhao H，F(xiàn)onseca JE.Osteoblast and bone formation［J］.Acta Reumatol Port，2007，32（2）：103.

［4］Frederic Shapiro.Bone development and its relation to fracture repair：The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts［J］.European Cells and Materials，2008，15：53.

［5］P.Chavassieux，E.Seeman，and P.D.Delmas.Insights into material and structural basis of bone fragility from diseases associated with fractures：How determinants of the biomechanical properties of bone are compromised by disease［J］.Endocrine Reviews，2008，28（2）：151.