韓 冬，徐 煌，鄭永霞，肖燕萍

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興314001）

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞），是一類存在于脂肪基質(zhì)中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細(xì)胞。ADSCs取材方便，是細(xì)胞治療的良好種子細(xì)胞來源［1］。klotho是一種抗衰老基因，其基因缺陷型動(dòng)物出現(xiàn)多種過早衰老的癥狀，如壽命縮短、骨質(zhì)疏松、皮膚肌肉萎縮、聽力下降、軟組織鈣化等［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，klotho可以影響細(xì)胞的增殖，因此本研究將klotho基因轉(zhuǎn)染至ADSCs中觀察其對(duì)ADSCs增殖能力的影響，為深入研究klotho基因功能及ADSCs作為種子細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，碘化丙碇（PI）購(gòu)自美國(guó)sigma公司，Cell Counting Kit－8（CCK－8）購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，兔抗人cyclinD1抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，質(zhì)粒 pcDNA3.1－GFP、pcDNA3.1－GFP－KL 由吉林圣元科技有限公司惠贈(zèng)。

1.2 ADSC的分離 取脂肪吸脂術(shù)的脂肪抽提物50mg，用PBS溶液反復(fù)沖洗3次，然后依次加入5 ml的0.5%胰酶和0.1%膠原酶，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)消化15min，1 000rpm離心10min后去上清，PBS沖洗3次后，低速離心，棄掉漂浮的脂肪及脂滴，200目紗網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，將分離的單細(xì)胞移入培養(yǎng)皿中，10%FBS的DMEM、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 Klotho基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將質(zhì)粒pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL （含有klotho全長(zhǎng)基因序列）通過轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染至ADSC中，具體操作按說明書進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染后24 h、48h、96h采用 CCK－8法測(cè)定細(xì)胞增殖。將pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的ADSC細(xì)胞懸液分別調(diào)整至濃度為2.5×105／ml接種于96孔板，每孔加200μl調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，每孔加入CCK－8溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔450nm處的OD值，以650nm波長(zhǎng)為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，以未轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組，以pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)組，按照公式：細(xì)胞增殖率＝實(shí)驗(yàn)組（A）／對(duì)照組（A）×100% 計(jì)算細(xì)胞增殖率，比較各組間增殖率的差異。

1.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá) 取第96h平行培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，胰酶消化，含血清的培養(yǎng)基終止胰酶的作用，收集細(xì)胞于離心管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)后4 000rpm離心5min，預(yù)冷PBS洗3次，棄上清，加入細(xì)胞裂解液150μl冰上孵育10min，14 000rpm離心10 min，收集上清。采用BCA蛋白定量法測(cè)定各組總蛋白濃度，取等量總蛋白在分離膠濃度為12%的條件下進(jìn)行SDS－PAGE電泳，電泳結(jié)束后常規(guī)轉(zhuǎn)膜，依次用兔抗人cyclin D1的一抗和羊抗兔酶標(biāo)二抗孵育，以β－actin為對(duì)照，檢測(cè)pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL 轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組cyclin D1的表達(dá)。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定ADSC的細(xì)胞周期 分別收集未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞1×106個(gè)于離心管中，1 000rpm離心5min，棄上清加入1ml 70%預(yù)冷的乙醇4℃過夜。1 000rpm離心5min，棄上清，用PBS離心洗滌2次，加入1ml DNA抽提緩沖液（192ml 0.2mol／L Na2HPO4與8ml 0.1mol／L枸櫞酸的混合溶液），混勻室溫放置5min，1 000 rpm離心5min棄上清，將細(xì)胞重懸于濃度為100 mg／L的PI溶液中，室溫避光染色30min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察分離和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ADSC形態(tài) 光鏡下觀察可見分離培養(yǎng)的ADSC呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為梭形，原代培養(yǎng)的細(xì)胞24h內(nèi)即貼壁生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL質(zhì)粒的ADSC在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，證明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染入ADSC中，見圖1。

圖1 分離及轉(zhuǎn)染后ADSC的細(xì)胞形態(tài)

2.2 CCK－8法測(cè)定細(xì)胞增殖 測(cè)定吸光度值后計(jì)算各組增殖率，pcDNA3.1－GFP－KL組與未轉(zhuǎn)染組相比ADSC的增殖率在第24h、48h、96h分別為124.75%、140.52%、175.50%。而 pcDNA3.1－GFP組與未轉(zhuǎn)染組相比的增殖率在第24h、48h、96h分別為100.99%、101.29%、100.22%，細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比無明顯差異，各組吸光度結(jié)果見表1，細(xì)胞形態(tài)見圖2。

2.3 cyclinD1蛋白的表達(dá)western blot結(jié)果顯示pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組與 pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比cyclin D1蛋白的表達(dá)水平明顯增高，結(jié)果見圖3。而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－GFP組和未轉(zhuǎn)染組相比cyclinD1蛋白的表達(dá)水平無明顯差異，而3組細(xì)胞的β－actin蛋白的表達(dá)無明顯差異。

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)間的吸光度值

圖2 未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染組96hADSC的細(xì)胞形態(tài)

圖3 western blot檢測(cè)各組細(xì)胞cyclinD1的表達(dá)

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 未轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，pcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組G0／G1期的細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），而S期細(xì)胞明顯增多（P＜0.05），G2／M 期細(xì)胞也增多（P＜0.05），而未轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.1－GFP轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞周期分析無明顯差異，結(jié)果見表2。

表2 流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞的細(xì)胞周期

3 討論

人klotho基因位于17號(hào)染色體的大臂，全長(zhǎng)5.2kb，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成［4］。Klotho是一種抗衰老基因，研究發(fā)現(xiàn)klotho基因發(fā)生突變可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)過早衰老癥狀及壽命縮短，而過表達(dá)klotho基因的小鼠則出現(xiàn)衰老抑制和壽命延長(zhǎng)［5］。Klotho基因通過雙向作用發(fā)揮抗衰老的作用，體現(xiàn)為一方面抑制腫瘤細(xì)胞增殖，另一方面促進(jìn)正常細(xì)胞增殖。已有研究證實(shí)Klotho基因可抑制IGF－1信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而klotho基因也可抑制過量的維生素D引起的細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞的有絲分裂來發(fā)揮其促進(jìn)正常細(xì)胞增殖作用［6，7］。klotho隨著年齡的增長(zhǎng)和某些疾病條件下其表達(dá)呈下降趨勢(shì)。在自發(fā)性高血壓大鼠和糖尿病大鼠中持續(xù)的高壓和氧化應(yīng)激使klotho表達(dá)明顯下降，在人慢性腎臟疾病中klotho表達(dá)也呈下降趨勢(shì)［8－10］，因此采用klotho基因轉(zhuǎn)染的手段，可以提高klotho在細(xì)胞的表達(dá)量，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖及抗衰老的目標(biāo)。

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞），是一類存在于脂肪基質(zhì)中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細(xì)胞，研究證實(shí)它可分化為脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種成體細(xì)胞。ADSCs可從吸脂術(shù)中的廢棄脂肪中分離，取材極為方便，ADSC認(rèn)為是替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于細(xì)胞移植的理想種子細(xì)胞。ADSC在體外培養(yǎng)時(shí)，血清濃度、細(xì)胞密度等培養(yǎng)條件對(duì)其增殖能力影響較大。在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)ADSC增殖周期為1w左右，如能提高ADSC的體外增殖能力，在體外大量擴(kuò)增ADSC，將為ADSC作為種子細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植、構(gòu)建工程化組織提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究中使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染手段，將Klotho基因轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的ADSC中，通過CCK－8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在轉(zhuǎn)染后96hpcDNA3.1－GFP－KL轉(zhuǎn)染組的增殖能力為未轉(zhuǎn)染組的175.50%，而通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染klotho基因后ADSC在靜止期（G0／G1期）細(xì)胞數(shù)明顯減少，而合成期 （S期）和有絲分裂期 （G2／M期）的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明ADSC轉(zhuǎn)染klotho基因后細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，而通過免疫組化的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSC中cyclinD1蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染klotho基因后明顯增高，而cyclinD1蛋白也是使細(xì)胞進(jìn)入合成期，促進(jìn)細(xì)胞增殖的必要條件，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明轉(zhuǎn)染klotho基因可增強(qiáng)體外培養(yǎng)ADSC的增殖能力。

Klotho作為抗衰老基因，其研究尚處于起步階段，其發(fā)揮抗衰老促進(jìn)正常細(xì)胞增殖的分子機(jī)制有待深入研究。本研究采用轉(zhuǎn)染klotho基因的方法提高了ADSC體外增殖能力，為進(jìn)一步研究klotho基因抗衰老的機(jī)制和將ADSCs用于細(xì)胞移植治療疾病打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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