單中杰，魏金星＊，韓前河，侯箐嵐

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州450052；2.鄭州人民醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州450003）

白藜蘆醇是從葡萄、花生、虎杖等藥用植物中提取的一種酚類化合物。近來研究［1］發(fā)現(xiàn)RES有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用。深入研究［2，3］發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，可顯著抑制前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌、垂體腺瘤等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。人程序化死亡分子5（the human programmed cell death 5，PDCD5）基因是由北京大學(xué)疾病研究中心在國際上首先從人白血病細(xì)胞株株TF－1細(xì)胞中克隆得到的凋亡相關(guān)新基因［5］。PDCD5在人體50多種組織中表達(dá)并參與細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控［4－7］。體外實(shí)驗(yàn)表明，PDCD5可促使多種腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)放、化療有協(xié)同作用。研究表明［8－11］PDCD5在撤除細(xì)胞因子、撤除血清、化療藥物處理等誘導(dǎo)因素，能顯著抑制多種癌細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，明顯促進(jìn)其凋亡。有關(guān)白藜蘆醇上調(diào)PDCD5的表達(dá)來誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的研究，至今國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討RES對(duì)人腎細(xì)胞癌細(xì)胞株786－0體外生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制，為其用于腎細(xì)胞癌的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人腎細(xì)胞癌細(xì)胞株786－0，中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑和儀器 白藜蘆醇（純度為99%）購自美國Sigma公司；二甲基亞砜，Sigma公司；流式細(xì)胞儀，德國Partec公司；DMEM培養(yǎng)液，美國HyClone公司；胎牛血清，北京中杉生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含有20%胎牛血清，1×105U／L青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PDCD5蛋白表達(dá)情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)／ml，接種于24孔板中（每培養(yǎng)孔放置直徑4mm×4mm的無菌蓋玻片），每孔1 ml，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入稀釋好的含白藜蘆醇濃度分別為12.5 μmol／L、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L 的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后取出固定。按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。對(duì)照組PBS替代一抗作為空白對(duì)照。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)以細(xì)胞漿內(nèi)有棕色顆粒樣物質(zhì)視為免疫陽性細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜蘆醇，處理細(xì)胞24h，并設(shè)空白對(duì)照組。離心收集，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)／ml各取1ml，PBS離心洗滌2次后，棄上清，加終濃度為70%的冰乙醇，置4℃冰箱固定過夜。檢測(cè)時(shí)再用PBS離心洗滌2次后，PI復(fù)合染液暗處染色20min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別用 12.5μmol／L、25μmol／L、50 μmol／L、100μmol／L的白藜蘆醇，處理細(xì)胞24h，并設(shè)空白對(duì)照組。離心收集，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)／ml各取1ml，PBS離心洗滌2次后，棄上清，PBS洗滌樣品細(xì)胞后，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（用蒸餾水1：4稀釋結(jié)合緩沖液），并調(diào)整細(xì)胞濃度為2－5×105／ml，取195μl細(xì)胞懸液，加入5μl Annexin－V－FITC混勻，室溫反應(yīng)10min，PBS洗滌一次，再以190μl稀釋的結(jié)合緩沖液，加入10μl的120μl／ml PI，用流式細(xì)胞儀分析，每個(gè)樣本收集20×103個(gè)細(xì)胞熒光信號(hào)，采用Cellquest軟件分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，計(jì)量資料用±s表示；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)（t－test），方差不齊時(shí)先進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換。以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Res作用后人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞形態(tài)的變化

正常情況下人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈梭形，圓形或多邊形，細(xì)胞輪廓清晰。不同濃度的Res作用于人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞后可見細(xì)胞形態(tài)縮小、變圓、核固縮、碎裂，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，懸浮細(xì)胞增多（圖1）。

圖1 RES對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（200X）

2.2 Res對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞PDCD5蛋白表達(dá)的影響

Res能明顯上調(diào)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞PDCD5蛋白的表達(dá)，4種不同濃度的白藜蘆醇作用于人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞24h后PDCD5蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組有所升高，同一時(shí)段內(nèi)隨著濃度增加，PDCD5蛋白表達(dá)增高，RES組與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比，12.5μmol／L與25、50、100μmol／L比較，P均＜0.05；但25μmol／L 與50、100μmol／L比較，P均＞0.05（表1、圖2）。

表1 白藜蘆醇對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞中PDCD5蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞中PDCD5蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與12.5μmol／L比較，△P＜0.05

Resveratrol μmol／L Action time（t／h）24 48 72 0 1.10±0.19 1.13±0.21 1.42±0.25 12.5 1.43±0.32＊ 1.57±0.14＊ 1.73±0.34＊25 2.90±0.13＊Δ 3.08±0.21＊Δ 3.23±0.21＊Δ 50 3.06±0.11＊Δ 3.18±0.23＊Δ 3.25±0.20＊Δ 100 3.17±0.45＊Δ 3.22±0.48＊Δ 3.30±0.46＊Δ

圖2 RES對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞PDCD5的影響（200X）

2.3 Res對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞周期的影響

人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞在Res作用24h后，隨著濃度的增高G1期及G2期比例顯著下降，S期比例明顯升高；不同濃度的Res對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為G1期及G2期細(xì)胞比例明顯降低，S期比例明顯升高。Res各濃度與對(duì)照組比較，P均 ＜0.05；12.5μmol／L 與 25、50、100 μmol／L比較，P均＜0.05（表3）；但25μmol／L與50、100μmol／L比較，P均＞0.05（表2）

表2 不同濃度Res對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞周期分布的影響（±s%）

表2 不同濃度Res對(duì)腎細(xì)胞癌細(xì)胞周期分布的影響（±s%）

注：空白對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與12.5μmol／L比較，△P＜0.05

Res濃度（μmol／L） G1期 S期 G2期0 75.23±2.58 13.17±1.36 11.35±2.37 12.5 73.19±3.63＊ 16.48±3.43＊ 10.16±0.25＊25 65.28±3.10＊△ 24.79±3.72＊△ 9.67±0.43＊△50 57.89±4.33＊△ 33.42±3.36＊△ 8.76±0.87＊△100 48.69±5.88＊△ 43.61±1.67＊△ 7.88±0.78＊△

2.4 Res對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞凋亡的影響

FCM檢測(cè)白藜蘆醇作用人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞24h后，顯著提高人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞的凋亡率，與對(duì)照組相比，12.5，25，50，100μmol／L白藜蘆醇組凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RES對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞凋亡的影響（24h）

3 討論

白藜蘆醇（Res），屬非黃酮類多酚化合物，分子式是C14H12O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)式是3，5，4’—三羥基—反—二苯乙烯，是植物在受到外來侵害時(shí)所產(chǎn)生的一種抗毒素。Res藥理作用廣泛，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)［1］的藥理作用包括有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤活性等。目前已有多項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)結(jié)果［1，3，7，9］表明，Res對(duì)某些癌癥，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等具有一定的抗癌作用，但具體機(jī)制還不是很清楚。深入研究［3］發(fā)現(xiàn)Res通過抑制細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)出易變性。Res顯著抑制食道癌增殖，使細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期比例明顯下降，使細(xì)胞停止于G1期。Ahmad［12］等發(fā)現(xiàn)Res能誘導(dǎo)CDK抑制蛋白 WAF1／p21的表達(dá)，使上皮樣癌細(xì)胞（A431）停頓于S期。

近來研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5在肝癌［13］、乳腺癌［14］、甲狀腺乳頭狀癌［15］、宮頸癌［16］中表達(dá)下降，且與腫瘤的惡性度呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)研究表明［8－11］PDCD5在化療藥物處理等誘導(dǎo)因素的作用下，能顯著抑制多種癌細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，明顯促進(jìn)其凋亡。但目前尚未發(fā)現(xiàn)Res對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞的生長(zhǎng)和PDCD5表達(dá)影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度Res對(duì)人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞的生長(zhǎng)和PDCD5的轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響，觀察腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和PDCD5的蛋白和mRNA的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的Res作用人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞24h，隨著RES的濃度增高，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增加，而PDCD5蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)典型凋亡峰，與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組凋亡率顯著增高，隨著濃度的增加G1期及G2期比例顯著下降，S期比例明顯升高，將人腎細(xì)胞癌786－0細(xì)胞阻滯于S期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，RES能明顯抑制體外培養(yǎng)的人腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促使其發(fā)生凋亡，且濃度為25μmol／L時(shí)，抑制作用最強(qiáng)。其機(jī)制可能與RES誘導(dǎo)PDCD5蛋白表達(dá)增加有關(guān)，但其抑制腎細(xì)胞癌的作用及其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。

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