吳金斌，漆正宇，晏耀明，翟慶娜，余振東

（1.北京大學深圳醫(yī)院 檢驗科，2.北京大學深圳醫(yī)院 男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 深圳518036）

膀胱癌是一類常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中移行細胞癌占膀胱癌發(fā)病率的90%以上［1］。染色質重建復合物SWI／SNF亞基AT豐富結合域1A基因（AT rich interactive domain 1A，ARID1A）是近兩年來腫瘤研究關注的一個重要基因，膀胱移行細胞癌中ARID1A高比率突變［2］，但我們前期測序發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞系T24中ARID1A可以正常表達。ARID1A作為一個染色質重建復合物亞基基因，跟細胞增殖密切相關［3］。本研究通過有限稀釋方法分離出膀胱移行細胞癌細胞系T24的高增殖活力亞克隆細胞株，體外評價ARID1A表達與細胞增殖轉移潛能關系，并為進一步研究ARID1A基因功能提供目的細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

基礎培養(yǎng)基 H－DMEM（Gibco USA），10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco USA），左旋谷氨酰胺（Gibco USA），青霉素和鏈霉素合劑（Invitrogen USA），胰 酶 （Gibco，USA），Trizol（Invitrogen，USA），CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）（Promega，USA），Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit（Invitrogen，USA）。

1.2 方法

1.2.1 T24細胞培養(yǎng) T24細胞系為本實驗室保存，傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基包括90% 基礎培養(yǎng)基HDMEM，和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），同時添加1mmol／L左旋谷氨酰胺、100U／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素合劑。細胞消化采用0.25%胰酶。在培養(yǎng)基中添加10%體積FBS和8%DMSO配成凍存液，按常規(guī)流程液氮凍存細胞。

1.2.2 高增殖亞克隆細胞株形成 將生長旺盛的T24細胞從培養(yǎng)皿消化后，稀釋到1×102個／ml，以1／2濃度梯度稀釋接種到96孔板中，5h內在倒置顯微鏡下觀察，標記單細胞孔，第10天將從單細胞擴增形成的細胞亞克隆傳至24孔板，得到亞克隆細胞株。亞克隆細胞株傳代培養(yǎng)至第3代，均一化接種培養(yǎng)并每天計數顯微鏡視野細胞數，估測篩選高增殖細胞株。

1.2.3 細胞增殖活力比較 采用CellTiter 96○RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay（a）試劑，MTS法檢測亞克隆細胞與T24親代細胞增殖活力，分別在1、3、5和7天選擇時間點檢測。

1.2.4 RT－qPCR 檢測 采用常規(guī) Trizol試劑提取細胞RNA。逆轉錄反應采用Fementas ReverseAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反應體系為20μl。采用 Platinum○RSYBR○RGreen qPCR SuperMix UDG kit對目的基因進行qPCR相對定量，比較細胞增殖相關基因CCND1（cyclin D1）表達，并通過定量膀胱癌腫瘤干細胞標志基因CD44來進一步驗證細胞增殖特性。定量ARID1A在不同增殖活力細胞中的表達。目的基因及內參GAPDH 跨外顯 子正反 向引物序列 （5′－3′）為：CCND1（sense：FGCATCTACACCGACAACTCCA ，antisense：GCACAGAGGGCAACG AAG）；CD44（sense：GTTCCTGGACTGAT，antisense：AATTACTCTGCTGCG TTG）；ARID1A（sense：AGGACGGAGCCTGGAATA，antisense：CCTTGGGTG GAGAACTG A）；GAPDH（sense：ATCATCAGCAATGCCTCC，antisense：CAT CACGCCACAGTTTCC）。PCR反應條件為94℃20sec，55℃20sec，72℃20sec，共35個循環(huán)。

2 結果

2.1 獲得高增殖亞克隆細胞株T24－9

T24分離得到65株亞克隆細胞，其中T24－9細胞株培養(yǎng)計數表現(xiàn)出較強的增殖活力。

2.2 T24－9細胞形態(tài)學特征

T24－9體積較親代T24明顯偏小，與T24的紡錘形外形不同，T24－9呈干細胞樣的細小圓球形（圖1）。

圖1 T24－9與T24細胞形態(tài)學差異（bar＝100μm）

2.3 細胞增殖活力定量比較

生長曲線顯示，除傳代第1天外，T24－9在第3、5和7天較T24具有更強的增殖活力（圖2）。

圖2 T24－9和T24生長曲線（n＝4）

2.4 基因轉錄水平比較

基因轉錄水平相對定量分析顯示，增殖相關基因CCND1在T24－9中較T24中顯著高表達。腫瘤干細胞標志物表達T24－9高于親代T24，但差異并不顯著。ARID1A的表達情況與CCND1類似，T24－9表達水平高于T24。

3 討論

ARID1A是染色質重建復合物SWI／SNF的一個亞基，能促進細胞的增殖，其缺失將嚴重干擾胚胎干細胞的正常發(fā)育［4］。從2010年發(fā)現(xiàn)ARID1A在子宮內膜異位相關卵巢癌中高達50%以上的突變以來［5，6］，ARID1A在腫瘤研究中受到極大關注。2011年發(fā)現(xiàn)膀胱移行細胞癌中ARID1A也有高達13%的突變［2］。雖然與細胞增殖有密切關聯(lián)，ARID1A在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用機制仍然未知。

圖3 T24－9和T24中CCND1、ARID1A和CD44轉錄水平比較（n＝3，P＜0.05）

本研究通過分離得到膀胱癌細胞系亞克隆T24－9，生長曲線顯示較親代T34細胞具有更強的增殖活力。CCND1表達的Cyclin D1蛋白是細胞G1／S期過渡的重要調控因子，促進細胞周期進行，其表達上調可以使細胞生長失控［7］。相對定量分析顯示，亞克隆T24－9比親代T24具有更高的CCND1表達量，進一步證實了T24中存在基因表達特點有差異的高增殖活力細胞亞群。

腫瘤干細胞理論認為，腫瘤細胞在成瘤能力上具有不均一性，只有少數高轉移潛能的腫瘤干細胞細胞亞群才有能力誘發(fā)并維持腫瘤惡性，只有征對腫瘤干細胞進行治療才有可能完全抑制腫瘤［8］。形態(tài)學顯示T24－9呈細小的圓球形快速生長。通過檢測膀胱癌腫瘤干細胞標志物CD44［9］，發(fā)現(xiàn)T24－9較T24的表達水平高，但差異不具有顯著性意義，可能是親代細胞系本身即具備了某種永生化特點，某些腫瘤干細胞標志物表達呈現(xiàn)陽性。結果表明，T24－9是一個具有腫瘤干細胞樣特點的細胞亞群。

ARID1A基因長達86kb，包含32個外顯子，cDNA長8kb，而且，ARID1A的在酵母中的正常轉錄量只有大約100個拷貝［3］，其功能研究受到其長度和表達量的雙重制約。我們測序發(fā)現(xiàn)T24膀胱癌細胞ARID1A正常表達，可以作為ARID1A功能研究一個目的細胞。分離高增殖活力的T24－9亞克隆，定量結果顯示T24－9中ARID1A表達量較親代細胞系有10倍以上的增加。作為一個促進細胞增殖的基因，ARID1A表達增加或許為細胞增殖所需要，而過度表達或許也是造成ARID1A突變的原因之一。高增殖活力的T24－9亞克隆細胞株的分離，為進一步研究ARID1A在膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的相關作用提供了基礎。

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