李 妍，王 海，張 鐸，李 瑤，曹慧玲

（1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林132013；2.吉林大學中日聯誼醫(yī)院檢驗科，吉林 長春130033；3.吉林醫(yī)藥學院科研處，吉林 吉林132013）

針對凋亡細胞的生物化學改變［1］，已經建立了多種基于FCM來檢測凋亡的方法。其中，碘化丙啶單染（propidium iodide，PI）單染法和 PI／AnnecxinⅤ 雙染法應用最為廣泛［2］。雙染法可精確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞。雖然PI單染法僅能檢測到晚期凋亡和壞死細胞，但因操作簡單、試劑廉價，更適合樣本量大的預實驗或新藥篩選。實踐中發(fā)現，細胞培養(yǎng)、收集和染色等環(huán)節(jié)，存在多處影響檢測結果的因素。本文以貼壁生長的Hela為例，從樣品制備的角度出發(fā)，討論影響PI染色檢測凋亡的因素。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞Hela引自美國典型物種保藏中心，去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）購自國家標準物質中心，胰蛋白酶（trypsin）、乙二胺四乙酸（EDTA）二鈉、PI和 Triton X－100和臺盼藍購自Sigma公司（美國）。RNase A購自碧云天生物技術研究所（上海）。1640培養(yǎng)液購自GBICO公司（美國），小牛血清購自浙江黃巖四季青生物技術公司。

1.2 試劑配制

1.2.1 Trypsin－EDTA 消化液 分別用pH7.4的0.01mol／L PBS配制5mg／ml trypsin溶液和2 mg／ml的 EDTA 溶液（用0.05mol／L NaOH 調pH為7.4），0.22μm 的濾器過率除菌后－20℃儲存。取兩種儲存液各1ml，加入無菌的8ml PBS配制為含0.5mg／ml trypsin和0.2mg／ml EDTA的消化液，該消化液中胰酶含量為通用消化的1／5。

1.2.2 PI染色液 用 PBS配制儲存液：10mg／ml PI，2%的 Triton X－100和20×10－3mol／L 的RNase A。使用PBS稀釋儲存液配制PI染色液：0.05mg／ml PI，0.2%Triton X－100和20×10－6mol／L的RNase A。

1.2.3 固定液配制 用去離子水配制80%的甲醇溶液，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)與藥物處理

用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃和飽和濕度條件下培養(yǎng)Hela細胞，取對數生長期細胞用于實驗。調細胞密度為5×104／ml，藥物處理前16h接于培養(yǎng)瓶（底面積25cm2），每瓶液體量為10ml，細胞數為5×105個。取PBS配制NCTD儲存液（20mmol／L），分別按終濃度為0，5，10和20μmol／L加入培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 樣品制備

按照如下步驟收集細胞。①將培養(yǎng)液轉移到50ml離心管。②5ml PBS沖洗培養(yǎng)瓶2次，液體轉入相同的50ml離心管。③加入1ml trypsin－EDTA消化液（室溫或37℃），搖動培養(yǎng)瓶，使其均勻分布。④倒置顯微鏡下觀察，待細胞邊緣開始卷縮，立即吸取適量離心管液體，加入培養(yǎng)瓶來終止消化，彎頭吸管輕柔吹打后將液體轉到離心管。⑤離心收集細胞，并用10ml PBS洗滌細胞1次。⑥適當體積PBS重懸細胞，取50μl細胞懸液，加入等量臺盼藍染液（0.4%），染色2min后以血細胞計數板計數細胞，計算細胞活力（活細胞白分率）。⑦取1×106個細胞，通過離心棄去PBS，邊震搖邊加入5ml 80%冷甲醇溶液固定細胞，－20℃保存，16h后可用進行染色分析，保存時間為2～4周。⑧離心棄去固定液，5ml PBS洗滌細胞2次。⑨末次離心棄去PBS后（殘液量約為100μl），邊震搖邊加入500μl PI染色液，室溫、避光處理30min。⑩300目尼龍網過濾細胞后，上流式細胞儀分析。

1.6 統計學分析

2 實驗結果

采用CXP 2.1軟件分析細胞周期和凋亡：前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）散點圖中設A門（圖1A）；AUX（顆粒相對面積）和FL3（PI熒光）散點圖中設多邊型門B（圖1B）；FL1（PI）直方圖中分析細胞周期和凋亡，與對照組比較20μmol／L NCTD導致Hela細胞G2／M期比例增加，同時誘導細胞凋亡（圖1C和圖1D）。Hela細胞凋亡和G2／M期細胞百分率均隨NCTD濃度增加而增加（表1）。

3 討論

圖1 PI染色流式細胞術分析Hela細胞凋亡

表1 NCTD對Hela細胞凋亡和周期的影響

細胞凋亡是生命科學研究的熱點之一，針對凋亡細胞形態(tài)學和生化化學改變已建立多種檢測細胞凋亡的方法。凋亡細胞PS翻轉，活細胞和早期凋亡時細胞膜通透性未改變，晚期凋亡和壞死時細胞通透性增加；AnnecxinⅤ－FITC可結合PS，PI不能進入活細胞和早期凋亡細胞。PI／AnnecxinⅤ 雙染法利用上述原理，可精確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞，但試劑成本高，不適合新藥篩選等工作。除血液來源腫瘤為懸浮生長，更多的實體腫瘤為貼壁生長。貼壁生長細胞或實體瘤在分析前需經消化、刮取或剪切處理過程，膜表面的PS等分子可部分脫落，從而影響凋亡分析［3］。處理過程也可能導致細胞膜通透性增加，改變早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞的比例，但PI染色法不受影響上述因素影響。目前，部分流式細胞儀配備了自動上樣裝置，PI單染法可做為藥學研究的高通量篩選方法。

本研究以Hela細胞，對樣品制備和PI染色關鍵環(huán)節(jié)加以優(yōu)化，主要包括如下幾方面。①選用低濃度PI來降低染色液的黏度，防止待檢過程中細胞間的黏附和沉降。②根據細胞生長特點，合理設定接種細胞的密度，過高的密度下細胞間“接觸抑制”影響周期，或因營養(yǎng)因子缺乏而導致細胞凋亡、壞死［4］。③避免殘留培養(yǎng)液對消化液的滅活，溫和、快速消化收集細胞。④收集培養(yǎng)上清中非貼壁的細胞，避免丟失處于分裂期或部分凋亡、壞死的細胞。⑤精確控制標本中細胞數目，使樣本間PI分子與DNA結合效率一致。⑥綜合分析凋亡率和細胞活力，判斷藥物對細胞的效應。改進方法清晰、穩(wěn)定地檢測到NCTD誘導細胞凋亡，與雙染法分析結果具有一致的趨勢［5］。本研究從制備樣品的角度出發(fā)，優(yōu)化了PI單染檢測凋亡的方法。

［1］陳朱波，曹雪濤.流式細胞術：原理、操作及應用［M］.北京：科學出版社，2010.

［2］Li Y，Wang R，Ma E，et al.The induction of G2／M cell－cycle arrest and apoptosis by cucurbitacin E is associated with increased phosphorylation of eIF2alpha in leukemia cells［J］.Anticancer Drugs.2010，21（4）：389.

［3］賈永蕊.曹雪濤.流式細胞術［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2010.

［4］Meshram M，Naderi S，McConkey B，et al.Population－based modeling of the progression of apoptosis in mammalian cellculture［J］.Biotechnol Bioeng，2010，109（5）：1193.

［5］An WW，Gong XF，Wang MW，et al.Norcantharidin induces apoptosis in HeLa cells through caspase，MAPK，and mitochondrial pathways［J］.Acta Pharmacol Sin，2004 ，25（11）：1502.