李 杰，梁守沛，陸?zhàn)┤?，孫鵬輝，王小龍，許 東，姚 武，周 舫#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科鄭州 450003 #通訊作者，女，1974年7月生，博士，副教授，研究方向:職業(yè)腫瘤，E-mail:zhoufang23@sina.com

肺腺癌組織中HSP70多肽復(fù)合物的分離及純化*

李 杰1)，梁守沛2)，陸?zhàn)┤?)，孫鵬輝1)，王小龍1)，許 東1)，姚 武1)，周 舫1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 2)鄭州人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科鄭州 450003 #通訊作者，女，1974年7月生，博士，副教授，研究方向:職業(yè)腫瘤，E-mail:zhoufang23@sina.com

肺腺癌;HSP70多肽復(fù)合物;蛋白分離純化

目的:探討肺腺癌組織中HSP70多肽復(fù)合物分離及純化的可行性方案。方法:采用裂解液裂解、超聲破碎、ConA-sepharose親和層析和DEAE陰離子交換層析方法，從肺腺癌組織中分離純化HSP70蛋白復(fù)合物;通過(guò)SDS-PAGE電泳、Western blot檢測(cè)獲得蛋白;運(yùn)用Bradford法對(duì)其進(jìn)行定量分析。結(jié)果:通過(guò)該實(shí)驗(yàn)方法可以從1 g肺癌組織中獲取110 μg左右的HSP70多肽復(fù)合物，其相對(duì)分子質(zhì)量為70 000。結(jié)論:采用ConA-sepharose親和層析和DEAE陰離子親和層析相結(jié)合的蛋白純化法可以獲取高純度的HSP70多肽復(fù)合物。

熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是與腫瘤密切相關(guān)的一類(lèi)具有分子伴侶和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白，其分子伴侶功能與一些癌基因、抑癌基因產(chǎn)物相互作用，參與腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等［1］。HSP70蛋白在腫瘤組織中高表達(dá)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，因此腫瘤源性的HSP70的作用越來(lái)越受到人們的重視，對(duì)腫瘤組織及細(xì)胞中HSP70多肽復(fù)合物的研究成為近年來(lái)的熱點(diǎn)，而要*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30600490;河南省教育廳科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃基金資助項(xiàng)目 2008HASTIT028;河南省教育廳自然科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目 2008A320018獲得高純度的HSP70多肽復(fù)合物，現(xiàn)有的純化方法并不完善。作者采用ConA-sepharose 4B親和層析與DEAE陰離子交換層析相結(jié)合的蛋白純化方法，從肺腺癌組織中分離純化出具有腫瘤源性的HSP70多肽復(fù)合物，并對(duì)其進(jìn)行定性檢測(cè)，為進(jìn)一步探討HSP70多肽復(fù)合物在腫瘤中的作用和以HSP70多肽復(fù)合物為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與色譜器材 組織標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1例肺腺癌患者行手術(shù)切除的肺腺癌組織并經(jīng)病理檢測(cè)確診。ConA-sepharose 4B親和層析凝膠、Hiprep DEAE FF 16/10預(yù)裝柱及快速蛋白液相色譜純化系統(tǒng)均購(gòu)自GE Healthcare公司。鼠抗人HSP70單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技科技有限公司。二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 蛋白的提取 取肺腺癌標(biāo)本，液氮研磨，加入組織裂解液裂解，勻漿，超速破碎(5 min，超聲功率設(shè)為200 W以不產(chǎn)生泡沫為宜，工作10 s，間歇10 s，30次)，4℃超速離心30 min，提取上清液，得到組織總蛋白(以上步驟均在冰上操作)。將收集的上清液中加入體積分?jǐn)?shù)為20%的無(wú)水乙醇、10 mmol/ L的MgCl2、10 mmol/L的CaCl2，4℃靜置30 min，隨后離心20 min。收集上清后立即加入4倍體積的超純水。

1.3 蛋白的分離及純化 將ConA-sepharose 4B親和層析柱用平衡緩沖液進(jìn)行平衡后，取上清液過(guò)ConA-sepharose 4B親和層析柱，收集不結(jié)合液體，4℃，放入預(yù)冷的透析液內(nèi)透析過(guò)夜，期間換透析液1次，然后將其放入－80℃冰箱迅速冷凍，真空凍干機(jī)中凍干濃縮。將凍干濃縮的樣品加到DEAE柱，用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離，20～500 mmol/L NaCl梯度洗脫，分別收集洗脫峰蛋白，4℃緩沖液中透析過(guò)夜，后4℃冰箱保存。采用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，將純化過(guò)程中每一步的產(chǎn)物都進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色和電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人HSP70單克隆抗體為一抗，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。

1.4 Bradford定量測(cè)量 用紫外分光光度計(jì)以Bradford比色法所測(cè)得含BSA的各標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值為縱坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)管中的BSA質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將分離純化提取獲得的目的蛋白樣品5 μL所測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)注曲線(xiàn)方程，即可得到目的蛋白樣品的含量。

2 結(jié)果

2.1 HSP70多肽復(fù)合物的分離與純化

2.1.1 ConA-Sepharose 4B親和層析 將總蛋白與過(guò)ConA-Sepharose 4B層析柱收集到的粗制品(包含HSP70的非糖蛋白組分)經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，可見(jiàn)與總蛋白相比較經(jīng)ConA-Sepharose 4B親和層析后，蛋白的組分明顯減少，除在70 000處出現(xiàn)一條明顯的條帶外，還有幾條位于45 000以下的其他幾條蛋白條帶(圖1)。

圖1 各色譜柱分離純化蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖

2.1.2 DEAE離子交換層析 將ConA-Sepharose 4B親和層析分離的粗制品經(jīng)快速蛋白液相色譜上的DEAE離子交換層析柱的充分分離，可見(jiàn)整個(gè)層析過(guò)程共有6個(gè)波峰出現(xiàn)(圖2)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可見(jiàn)第3個(gè)波峰在70 000處出現(xiàn)一條蛋白條帶(圖2)。

圖2 HSP70的DEAE陰離子親和層析色譜圖

2.2 蛋白的鑒定和定量結(jié)果 Western blot分析結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 色譜柱分離純化蛋白樣品的Western blot結(jié)果

由圖3可知，純化所獲得第3波峰的蛋白確系目的蛋白HSP70多肽復(fù)合物。目的蛋白樣品的含量為110 μg/g。

3 討論

有研究［2］表明，HSP70在肺癌細(xì)胞和組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)，并與肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HSP70是具有免疫調(diào)節(jié)性能的應(yīng)激性蛋白，在腫瘤的免疫治療中效果非常顯著［3］。HSP70在腫瘤免疫中的作用是多途徑的，不僅僅局限于某一種腫瘤，而是適用于多種腫瘤［4-5］。盡管，HSP70多肽復(fù)合物作為腫瘤疫苗已經(jīng)開(kāi)始臨床應(yīng)用研究，部分腫瘤已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床研究，在動(dòng)物體內(nèi)觀(guān)察到的HSP抗腫瘤免疫效應(yīng)在人體內(nèi)得到了初步的證實(shí)［6］，但是關(guān)于HSP70多肽復(fù)合物的研究仍存在不少問(wèn)題，需進(jìn)一步探索。因此，如果能夠從腫瘤組織中分離純化出具有腫瘤免疫活性的高純度的HSP70多肽復(fù)合物，將為腫瘤免疫防治以及新型抗腫瘤疫苗的開(kāi)發(fā)提供一種全新的途徑。

作者根據(jù)HSP70的理化性質(zhì)并結(jié)合有關(guān)的純化文獻(xiàn)［7-9］設(shè)計(jì)出一套相對(duì)簡(jiǎn)單有效的純化法案。首先將經(jīng)過(guò)勻漿，裂解，破碎，離心得到的總蛋白上清液進(jìn)行預(yù)處理，使其通過(guò)低有機(jī)溶劑沉淀以去除DNA和部分雜質(zhì)，降低樣品的黏度和雜質(zhì)蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用常衛(wèi)紅［10］的沉淀?xiàng)l件取得了滿(mǎn)意的效果。

然后，利用ConA-sepharose 4B親和層析介質(zhì)對(duì)于糖蛋白的特殊親和作用將其分為與層析介質(zhì)結(jié)合的糖蛋白和不與其結(jié)合的不含有糖蛋白的HSP70-腫瘤肽復(fù)合物以及其他一些非糖蛋白，完成了對(duì)樣品的初步純化。由于HSP70的等電點(diǎn)在pH值5.6左右，在pH值為7.5的緩沖液中帶負(fù)電荷，故選擇借助快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)，通過(guò) Hiprep DEAE-sepharose FF 16/10陰離子交換層析柱對(duì)初步純化得到的蛋白組分進(jìn)行梯度洗脫。FPLC在中等壓力條件下工作，比傳統(tǒng)色譜分離更快，分離效果更好;相對(duì)于高壓系統(tǒng)，其設(shè)備用塑料而非不銹鋼制成，可耐任何緩沖液。DEAE-sepharose離子交換劑有很好的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，具有極好的流速，對(duì)較寬相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白分子均有極高的容量，在pH值為7.5的緩沖液中能與HSP70多肽復(fù)合物很好的結(jié)合。通過(guò)改變緩沖液中NaCl的濃度(0～1 mol/L)對(duì)其進(jìn)行線(xiàn)性梯度洗脫，經(jīng)快速蛋白液相色譜儀的紫外檢測(cè)可知，在電導(dǎo)為25%～35%(NaCl的濃度為0.25～0.35 mol/L)條件下所收集到的蛋白組分經(jīng)SDS-PAGE和Western blot定性鑒定，最終證實(shí)該純化蛋白即為目的蛋白——HSP70多肽復(fù)合物。經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程可從1 g肺癌組織中獲取110 μg左右的HSP70多肽復(fù)合物，相對(duì)分子質(zhì)量為70 000。

該分離純化方法費(fèi)用較低，特異性高，具有很好的實(shí)用性，同時(shí)高純度的HSP70多肽復(fù)合物的提取將為進(jìn)一步研究HSP70多肽復(fù)合物腫瘤疫苗提供重要依據(jù)，也為HSP70多肽復(fù)合物的相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

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Separation and purification of heat shock protein 70 peptide complex from human lung adenocarcinoma tissue

LI Jie1)，LIANG Shoupei2)，LU Haoquan1)，SUN Penghui1)，WANG Xiaolong1)，XU Dong1)，YAO Wu1)，ZHOU Fang1)1)Department of Occupation Health，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)Department of Medical Administration，Zhengzhou People’s Hospital，Zhengzhou 450003

lung adenocarcinoma;HSP70 peptide complex;protein separation and purification

Aim:To explore a method of separating and purifying HSP70 peptide complex from human lung adenocarcinoma.Methods:HSP70 peptide complex was separated and purified from human lung adenocarcinoma tissue by means of cell lysis，ultrasonication，ConA-sepharose column，and DEAE ion-exchange chromatogaraphy.The purified fractions were tested by SDS-PAGE and Western blot.And quantitative analysis was made by Bradford.Results:About 110 μg HSP70 peptide complex was obtained from 1 g lung adenocarcinoma tissue by this experimental method，with relative molecular weight of 70 000.Conclusion:The high purity HSP70 peptide complex could be obtained by ConA-sepharose column and DEAE ion-exchange chromatogaraphy.

R135.99

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.002

(2012-01-11收稿 責(zé)任編輯趙秋民)