賀廣珍，李金運(yùn)，張敬川

(1.徐州市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 徐州221002;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 徐州221002)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)病死率僅次于肺癌，居于第2 位，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［1］。盡管已發(fā)現(xiàn)若干相關(guān)分子標(biāo)志物，但現(xiàn)有證據(jù)還不足以充分解釋乳腺癌的發(fā)病原因。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)，從分子水平探索乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，具有十分重要的意義。

BP1 基因是在研究β 珠蛋白表達(dá)調(diào)控時(shí)被發(fā)現(xiàn)并命名的，序列分析表明BP1 是同源盒基因，屬于DLX家族。有研究［2］顯示在白血病中BP1 基因高表達(dá)且具有癌基因特性，其高表達(dá)增加K562 細(xì)胞在體外致白血病的能力。BP1 是DLX 家族中第1 個(gè)與乳腺癌密切相關(guān)的基因，在乳腺癌分子水平研究中發(fā)現(xiàn)BP1直接結(jié)合Bcl-2 啟動(dòng)子并上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，Bcl-2 是一種抗凋亡基因。為進(jìn)一步探討B(tài)P1 在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及初步探討其可能的機(jī)制，本研究采用Western blot 及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)45 例乳腺癌組織、相應(yīng)癌旁組織中BP1 的表達(dá)和乳腺癌組織中Bcl-2的表達(dá)，探討B(tài)P1 與乳腺癌臨床病理因素及其與Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 45 例乳腺癌組織取自徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科2008年3月至9月手術(shù)切除組織。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療，均為女性，年齡29 ～85歲，中位年齡47.5 歲。取材于手術(shù)標(biāo)本離體20 min內(nèi)進(jìn)行，癌組織為腫瘤中心處非壞死組織;相應(yīng)癌旁組織為距癌灶邊緣至少5 cm 的正常乳腺組織。所有癌組織及相應(yīng)癌旁組織術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)。取材后標(biāo)本迅速置于液氮中凍存，然后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。再切取1 cm×1 cm×1 cm 大小的標(biāo)本分別放入2 個(gè)裝有多聚甲醛液體的廣口瓶中固定。組織學(xué)類型依據(jù)WHO(2003)對(duì)乳腺腫瘤病理學(xué)的分類標(biāo)準(zhǔn);TNM 分期依據(jù)AJCC(2010)第7 版《乳腺癌TNM 分類及分期》的標(biāo)準(zhǔn)。雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、CerbB-2 及Ki-67 為醫(yī)院病理科乳腺癌常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。

1.2 主要試劑 兔抗BP1 多克隆抗體為Novus Biologicals 公司產(chǎn)品。小鼠抗Bcl-2 單克隆抗體、鼠抗βactin 單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)志的馬抗小鼠抗體、堿性磷酸酶標(biāo)志的羊抗兔抗體均為Santa Cruz 公司產(chǎn)品。硝酸纖維過(guò)濾膜為Sigma Biotechnology 公司產(chǎn)品。NBT/BCIP 顯影劑為Promega 公司產(chǎn)品。即用型SABC 免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB 顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Western Blot 測(cè)定癌組織中BP1、Bcl-2 和癌旁組織中BP1 表達(dá) 將-80 ℃冰箱中凍存的癌組織和相應(yīng)癌旁組織取出，各稱取100 mg 組織放入EP 管中，剪刀剪碎，加入1 mL 勻漿液后立即用勻漿器在冰水浴中高速勻漿至無(wú)肉眼可見(jiàn)的組織塊，然后12 000 r ·min-1、4 ℃離心15 min。小心移取上清液。按改良的Lowary 法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定蛋白濃度，測(cè)定蛋白后分裝，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩⑻崛〉牡鞍踪|(zhì)與等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸3～5 min 進(jìn)行蛋白質(zhì)變性。按Jiang 等［3］方法等量蛋白樣品(每個(gè)泳道10-9g)經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PADE)分離后，以半干轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗BP1 多克隆抗體(一抗)，1∶1 000;鼠抗Bcl-2 單克隆抗體(一抗)，1 ∶2 000;鼠抗β-actin 單 克隆抗體(一抗)，1∶1 000。4 ℃過(guò)夜。次日用緩沖液洗膜3 次，加入相應(yīng)的二抗(堿性磷酸酶標(biāo)志的羊抗兔抗體，堿性磷酸酶標(biāo)志的馬抗小鼠抗體1∶1 000)，37 ℃反應(yīng)2 h。洗膜3 次，以新鮮配制NBT/BCIP 顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果以圖像處理儀(Gene 公司)掃描，Image J軟件進(jìn)行半定量分析。BP1 蛋白的表達(dá)量是以BP1相應(yīng)條帶的A 值除以β-actin相應(yīng)條帶的A 值得到的結(jié)果;Bcl-2 蛋白的表達(dá)量是以Bcl-2 相應(yīng)條帶的A 值除以β-actin 相應(yīng)條帶的A 值得到的結(jié)果。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定癌組織中BP1、Bcl-2和癌旁組織中BP1 表達(dá) 石蠟包埋乳腺組織標(biāo)本，以片厚6 μm 連續(xù)切片，切片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)，即用型SABC免疫組化試劑盒A 液封閉，37 ℃1 h;滴加一抗:BP1(1∶300);Bcl-2(1∶500)。4 ℃過(guò)夜;滴加B 液，37 ℃1 h;滴加C 液，37 ℃0.5 h。以上各步驟之間均用0.01 mol ·L-1緩沖液沖洗3 次，每次5 min。經(jīng)DAB 顯色后蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。BP1 主要在上皮細(xì)胞的胞質(zhì)和部分胞核中表達(dá)，Bcl-2 在乳腺上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，相應(yīng)部位呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)［4］。細(xì)胞計(jì)數(shù):在顯微鏡下按統(tǒng)一放大倍數(shù)(×40 )進(jìn)行分析，3 名操作者獨(dú)立將每張切片按等距抽樣原則隨機(jī)攝取5 個(gè)視野。圖像采集后用Image-Pro Plus 6.0 輔助圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量以±s 表示，連續(xù)變量組間比較采用t 檢驗(yàn);兩變量間的關(guān)系采用Pearson 相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BP1 及Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況 Western blot 方法測(cè)定結(jié)果:癌組織中BP1 蛋白表達(dá)水平為0.949 ±0.593，相應(yīng)癌旁組織中為0.095 ±0.057(圖1)，癌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平為0.644 ±0.388(圖2)。免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)量結(jié)果:癌組織中BP1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為303.30 ±154.21，癌旁組織中BP1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為104.08 ±57.97(圖3)，癌組織中Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為214.26 ±129.16 (圖4)。經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn)分析(表1)，BP1 在癌組織的表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＜0.01)。采用Pearson 相關(guān)分析，乳腺癌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平與BP1 蛋白表達(dá)水平，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r =0.678，P ＜0.05)(表2);乳腺癌組織中Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與BP1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)水平，兩者表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r =0.653，P ＜0.05)。

2.2 BP1 的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系BP1 高表達(dá)與ER、PR 及C-erbB-2 有關(guān)(P ＜0.05)，而與患者年齡、絕經(jīng)狀況、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、Ki-67 無(wú)關(guān)(P ＞0.05)(表3)。

3 討論

BP1 是在研究β 珠蛋白表達(dá)調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)的，已克隆的BP1 cDNA 全長(zhǎng)為1 251 bp，開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)約720 bp，編碼240 個(gè)氨基酸，具有螺旋狀的同源異型結(jié)構(gòu)域［5］。BP1 屬于DLX 亞家族，又被稱為DLX9，與DLX4 和DLX7 互為異構(gòu)重整體［6］。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BP1 與Bcl-2在乳腺癌組織中的表達(dá)(A:Bcl-2 蛋白，B:BP1 蛋白，×400)

表1 BP1 在乳腺癌組織與相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

表2 乳腺癌組織中BP1 與Bcl-2 表達(dá)的相關(guān)性

Man 等［7］發(fā)現(xiàn)BP1 蛋白在81%浸潤(rùn)性乳腺癌中表達(dá)，而在原位癌、增生性病變及正常組織中表達(dá)分別為46%、21%和0%，表明BPl 蛋白可能是腫瘤形成過(guò)程中一個(gè)重要的上調(diào)因子。Man 等［8］研究發(fā)現(xiàn)炎性乳腺癌組織中BP1 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和免疫染色強(qiáng)度均明顯高于非炎性乳腺癌組織，BP1 蛋白有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性。本文結(jié)果顯示:癌組織BP1 蛋白表達(dá)水平為0.949 ±0.593，相應(yīng)癌旁組織為0.095 ±0.057;癌組織BP1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為303.30 ±154.21，癌旁組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為104.08 ±57.97。經(jīng)配對(duì)t 檢驗(yàn)分析，BP1 在癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織。提示BP1 蛋白可能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

表3 BP1 蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系

ER、PR 及C-erbB-2 是判斷乳腺癌內(nèi)分泌敏感性的重要的臨床病理指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn):1)BP1 與患者年齡、絕經(jīng)狀況、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、Ki-67均無(wú)關(guān);2)BP1 與ER、PR 及C-erbB-2 有關(guān)(P ＜0.05)，隨著ER、PR 陽(yáng)性率的增加，BP1 表達(dá)水平降低。Fu 等［9］利用RT-PCR 方法證實(shí)BP1 的表達(dá)率在ER 陽(yáng)性組顯著低于陰性組。本文結(jié)果與之一致。Stevenson 等［10］的研究結(jié)果顯示當(dāng)應(yīng)用TNF-α 針對(duì)性治療MCF7 細(xì)胞(ER 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株)時(shí)，BP1 高表達(dá)的MCF7 細(xì)胞存活率增加約2 倍。Fu 等［11］發(fā)現(xiàn)在ER 陰性的乳腺癌Hs578T 細(xì)胞株中，BP1 高表達(dá)顯著增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的潛能;隨C-erbB-2 陽(yáng)性率的增加，BP1 表達(dá)水平升高，分析可能的原因?yàn)?1)BP1 基因圖譜與C-erbB-2 臨近，定位于17q21 ～22［6］;2)BP1 蛋白與C-erbB-2 蛋白都共定位在乳腺癌細(xì)胞的亞型中，且共定位的細(xì)胞數(shù)隨原位癌至浸潤(rùn)癌的進(jìn)展而增加［10］;3)BP1 基因擴(kuò)增與HER2/NEU 基因擴(kuò)增有顯著的相關(guān)性［12］。ER、PR 低表達(dá)與C-erbB-2 高表達(dá)的腫瘤通常與更高的治療抵抗和更差的預(yù)后有關(guān)。因此，BP1 高表達(dá)可能與臨床難治腫瘤的預(yù)后和治療有關(guān)，檢測(cè)BP1 在乳腺癌組織中的表達(dá)可以更好地指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后。由于BP1 的高表達(dá)，在所有ER 陰性的乳腺癌中，BP1 可能成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

抑制細(xì)胞凋亡是腫瘤形成與發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵步驟，腫瘤細(xì)胞逃避凋亡歸因于抑癌基因的失活以及癌基因的激活。Vaux 等［13］首先報(bào)道了Bcl-2 有延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間、抑制細(xì)胞凋亡的作用。非整倍體腫瘤較整倍體腫瘤更過(guò)度表達(dá)Bcl-2，說(shuō)明Bcl-2 可通過(guò)抑制凋亡而加強(qiáng)基因不穩(wěn)定性［14］，過(guò)度表達(dá)的Bcl-2 在不影響細(xì)胞增殖的情況下阻止細(xì)胞凋亡。Oh 等［15］研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 通過(guò)抗細(xì)胞凋亡和自噬抑制作用2 個(gè)途徑抑制腫瘤的發(fā)生。Bcl-2 參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其中包括乳腺癌。Stevenson 等［10］研究發(fā)現(xiàn)在MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中，BP1 通過(guò)直接結(jié)合Bcl-2 P1 啟動(dòng)子區(qū)域上游，轉(zhuǎn)錄激活Bcl-2 基因，導(dǎo)致Bcl-2 蛋白增加。本文結(jié)果:乳腺癌組織中BP1 蛋白表達(dá)水平為0.949 ±0.593，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平為0.644 ±0.388(r=0.678，P=0.00);免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示癌組織中BP1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為303.30 ±154.21，Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為214.26 ±129.16(r =0.653，P =0.001)。BP1與Bcl-2 在癌組織中的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，BP1 可能亦轉(zhuǎn)錄激活Bcl-2 基因，增加Bcl-2 蛋白的表達(dá)。王洋等［16］的研究結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，BP1 mRNA陽(yáng)性組凋亡細(xì)胞數(shù)少于BP1 mRNA 陰性組。由此可見(jiàn)，BP1 可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2 抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，這可能是其發(fā)揮致癌作用機(jī)制之一。

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