王弘珺 李質(zhì)馨 楊 柳 田洪艷 徐 冶 朱辛為 劉忠平

(吉林醫(yī)藥學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

60%～80%的雌性NOD小鼠出生后12 w會(huì)自發(fā)出現(xiàn)糖尿病癥狀，屬于1型糖尿病，是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。研究表明，Th1細(xì)胞分化發(fā)育異常在1型糖尿病的發(fā)生中起重要作用〔1〕。本文選擇4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠，測(cè)定不同年齡NOD小鼠血糖的變化及脾和胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞的變化，探討Th1細(xì)胞在NOD小鼠糖尿病早期中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 4 w、8 w和16 w清潔級(jí)(SPF)NOD雌性小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，每組6只。熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4、CD25和干擾素-γ(IFN-γ)單抗及同型對(duì)照抗體BD，抗小鼠免疫球蛋白受體(FcR)單抗(自制)，抗T-bet抗體(武漢博士德)，鏈霉素生物蛋白過(guò)氧化物酶法(S-P)試劑盒(福州邁新生物)，離子霉素(Ionomycin，lon)和佛波醇酯(PMA)(Sigma)。Golgi Stop BD，流式細(xì)胞儀和血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生)。

1.2 方法

1.2.1 血糖檢測(cè) 無(wú)菌取小鼠尾靜脈血用血糖儀檢測(cè)血糖。

1.2.2 脾細(xì)胞的制備 乙醚麻醉，取小鼠脾，用毛玻璃片擠壓，過(guò)200目尼龍網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，懸浮于PBS中，計(jì)數(shù)。

1.2.3 脾Th1細(xì)胞的測(cè)定 取2×106細(xì)胞用PMA和Ionomycin活化4～6 h，同時(shí)加入Golgi Stop，CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的染色過(guò)程按照BD說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 胰腺免疫組化 取胰腺，10%中性甲醛緩沖液4℃固定24 h，然后各級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。常規(guī)石蠟切片，梯度酒精脫水，抗原修復(fù);雙蒸水洗入3%H2O210 min，PBS洗滌;山羊血清室溫封閉10 min;加1∶100稀釋抗T-bet抗體，4℃過(guò)夜，PBS洗滌;生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體室溫10 min，PBS洗滌;SD室溫10 min，PBS洗滌;DAB顯色2 min，脫水透明封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用s表示，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血糖的變化 實(shí)驗(yàn)所用雌性NOD小鼠，4 w時(shí)血糖為(5.08±0.22)mmol/L，8 w 時(shí)血糖為(6.48±0.53)mmol/L，16 w時(shí)血糖為(11.59±0.92)mmol/L，血糖呈進(jìn)行性增高，16 w與8、4 w之間差異顯著(P＜0.01，P＜0.001)。

2.2 CD脾Th1細(xì)胞的變化 Th1細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌細(xì)胞因子IFN-γ，CD4+IFN-γ+T細(xì)胞即為 Th1細(xì)胞。4、8、16 w NOD小鼠脾Th1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為(2.46±0.10)%、(2.84±0.30)%及(5.07±0.91)%，16 w NOD小鼠脾Th1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)高于4 w和8 w NOD小鼠(P＜0.05;P＜0.01)。

2.3 胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞的變化 4 w NOD小鼠胰腺內(nèi)未見(jiàn)Th1細(xì)胞浸潤(rùn)，從8 w開(kāi)始NOD小鼠胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增加。見(jiàn)圖1。

圖1 胰腺Th1細(xì)胞免疫組化(×200)

3 討論

NOD小鼠出生4 w開(kāi)始胰島周?chē)饾u出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，12 w時(shí)60%～80%雌性小鼠出現(xiàn)糖尿病癥狀，并進(jìn)行性加重，其糖尿病病理變化和臨床表現(xiàn)均類(lèi)似人類(lèi)1型糖尿病，是目前研究1型糖尿病的主要?jiǎng)游锬Ｐ汀＜?xì)胞免疫異常是引起NOD小鼠發(fā)生糖尿病的原因之一，尤其是CD4+T細(xì)胞亞群分化失衡在糖尿病進(jìn)程中起重要作用〔1，2〕。CD4+T細(xì)胞亞群主要有Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞，其中Th1釋放 IFN-γ、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)引起炎癥反應(yīng)，與糖尿病時(shí)胰島β細(xì)胞凋亡有關(guān)〔3〕，直接參與了糖尿病的發(fā)生過(guò)程。目前，對(duì)于NOD小鼠糖尿病初期外周和胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞的變化并不完全清楚。本文研究了4 w、8 w和16 w雌性NOD小鼠血糖的變化及脾和胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞的變化。本研究中，隨年齡增加雌性NOD小鼠血糖逐漸升高，至16 w時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)高血糖，并出現(xiàn)其他糖尿病癥狀如尿糖陽(yáng)性等。為了研究Th1細(xì)胞的變化，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了脾Th1細(xì)胞，通過(guò)免疫組化檢測(cè)了胰腺內(nèi)Th1細(xì)胞。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示4 w、8 w和16 w NOD小鼠脾Th1細(xì)胞逐漸升高，16 w時(shí)NOD小鼠脾Th1細(xì)胞顯著高于4 w時(shí)。說(shuō)明，NOD小鼠糖尿病早期外周Th1細(xì)胞亞群異常增加，其原因可能與CD4+CD25+Treg細(xì)胞不足有關(guān)。有研究表明，1型糖尿病中CD4+CD25+Treg細(xì)胞有缺陷，不能維持自身免疫耐受〔4～8〕，這可能引起Th1細(xì)胞增加，導(dǎo)致NOD小鼠發(fā)生糖尿病。

T-bet是誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，4 w NOD小鼠胰腺內(nèi)并未檢測(cè)到T-bet陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明這時(shí)Th1細(xì)胞沒(méi)有明顯浸潤(rùn)到胰腺。在8 w和16 w NOD小鼠胰腺內(nèi)檢測(cè)到大量的T-bet陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明Th1細(xì)胞大量浸潤(rùn)胰腺，參與胰腺β細(xì)胞凋亡，于是出現(xiàn)高血糖等糖尿病癥狀。

1型糖尿病患者主要為青少年，糖尿病表現(xiàn)是由于胰島β細(xì)胞破壞所引起。免疫因素在1型糖尿病發(fā)生中起重要作用，尤其是Th1細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子在糖尿病發(fā)生早期起關(guān)鍵作用。在1型糖尿病發(fā)生早期，通過(guò)中西藥治療降低Th1細(xì)胞，減輕胰島β細(xì)胞凋亡，能夠延緩糖尿病癥狀的出現(xiàn)。

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