涂 玲 梁穎紅 劉 佳 張俊華 魏 明 杜 英 (鄭州大學基礎醫(yī)學院，河南 鄭州 450052)

本研究旨在觀察多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠在病程不同階段血清巨噬細胞移動抑制因子(MIF)含量的變化、反映免疫狀況的外周血單核細胞MHC-Ⅱ類分子(IAb)表達規(guī)律及T淋巴細胞亞群的變化，分析MIF釋放量的變化與單個核細胞免疫功能相關指標異常的關系，初步認識MODS發(fā)生、發(fā)展中MIF釋放的規(guī)律及其對細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及動物模型 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠100只，體重20～25 g，鄭州大學實驗動物中心提供。動物適應性飼養(yǎng)1 w，飼以標準食物。實驗前12 h禁食，自由飲水。動物隨機分為正常組，酵母多糖致傷后 3、8、12 h 和傷后 1、2、3、5、12 d共9組。采用腹腔注射無菌酵母多糖的方法制作MODS模型〔1〕。實驗組動物腹部皮膚常規(guī)消毒后，無菌注射酵母多糖懸液(2.5 g/100 ml石蠟油，注射劑量1 g/kg體重)。

1.2 血清MIF含量 分別取各時間點動物血清24 μl加6 μl 5×凝膠加樣緩沖液，混勻后100℃水浴5 min，離心后上樣，12%分離膠電泳;轉(zhuǎn)膜，免疫印跡:一抗為抗小鼠MIF多抗，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，稀釋度分別為1∶3 000和1∶2 000。用化學發(fā)光法進行檢測(Pierce公司)。

1.3 外周血單核細胞MHC-Ⅱ類分子(IAb)表達 取小鼠眼球血 100 μl，加入 FITC 標記 IAb 抗體5 μl，經(jīng)裂解紅細胞、避光孵育、固定后，用射門法在流式細胞儀(BD公司)上測定IAb陽性細胞數(shù)并計算其百分比。

1.4 外周血T淋巴細胞亞群的分析 從小鼠眼球取血100 μl，肝素抗凝;加入 FITC-CD4 抗體和 PE-CD8 抗體各 5 μl，混勻后避光孵育30 min;加入紅細胞裂解液后再避光孵育8 min;室溫離心(1 500 r/min，5 min);細胞沉淀加入0.1 ml 4%多聚甲醛和0.4 ml PBS吹打混勻;用射門法在流式細胞儀上檢測FITC-CD4抗體和PE-CD8抗體標記的淋巴細胞并分別計數(shù)，計算CD4+/CD8+細胞比值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Stata7.0軟件分析，數(shù)據(jù)以s表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血清MIF含量的變化 正常組及酵母多糖致傷后3、8 h組血清未檢測到MIF蛋白表達條帶，12 h組血清可見MIF表達帶，表達量為(0.63±0.19)ng/ml，1 d組表達量最多，為(1.43±0.28)ng/ml，隨后逐漸降低，5 d組未測到，但10 d組又增至較高水平，為(0.89±0.24)ng/ml。

2.2 外周血單核細胞IAb表達的規(guī)律 正常組外周血單個核細胞IAb表達量在30%以上;注射酵母多糖后8 h，外周血單個核細胞IAb表達量明顯下降(P＜0.05);傷后2 d，IAb表達更少(P＜0.01)，傷后5 d IAb表達量有所恢復，但仍未達到正常組水平;傷后10 d，IAb表達再次下降，不足正常組的1/3(P＜0.01)，與5 d組比較也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 外周血單個核細胞IAb表達和T淋巴細胞CD4+/CD8+比值的變化(n=10，s)

表1 外周血單個核細胞IAb表達和T淋巴細胞CD4+/CD8+比值的變化(n=10，s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與5 d組比較:3)P＜0.05

組別 IAb陽性率 CD4+/CD8+32.46±6.57 3.32±0.78 MODS組 8 h 18.56±4.821) 1.33±0.241)2 d 13.54±3.652) 1.07±0.212)5 d 24.78±6.14 1.82±0.431)10 d 9.87±2.782)3) 0.70±0.172)3)正常組

2.3 外周血T淋巴細胞亞群的變化 注射酵母多糖8 h組，CD4+細胞比例減少，而CD8+細胞比例增加，兩者比值降低(P＜0.05);傷后2 d組，CD4+細胞比例降至最低，同時CD8+細胞比例也減少，兩者比值仍在低水平(P＜0.01);傷后5 d，CD4+細胞比例增加，CD4+/CD8+細胞比值雖有增加，但仍低于正常組;傷后10 d，CD4+細胞比例再度減少，而CD8+細胞比例明顯增加，CD4+/CD8+比值小于1。

2.4 血清MIF含量與CD4+/CD8+比值及外周血單核細胞IAb表達水平的關系 在病程早期的傷后12 h，血清MIF急劇升高，而此時CD4+/CD8+比值下降;傷后5 d進入緩解期，血清MIF水平降至接近正常，CD4+/CD8+比值也有所恢復;當進入第2次打擊的傷后10～12 d時，血清MIF水平再度升高，并伴隨CD4+/CD8+比值再次下降。

3 討論

MIF不僅可抑制巨噬細胞的自由移動，參與遲發(fā)性超敏反應，還具有多種其他生物學作用。作為一種作用廣泛的前炎癥因子，MIF可參與宿主對微生物感染時發(fā)生的系列應激反應，能活化巨噬細胞，抑制其游走移動，增強其黏附、吞噬作用及殺滅腫瘤的活性。它是部分炎癥性疾病中的關鍵介質(zhì)，尤其在介導內(nèi)毒素和膿毒癥休克中起著關鍵作用。

本研究采用腹腔注射過量酵母多糖引起免疫反應過高和炎癥反應遷延失控，進而誘發(fā)膿毒癥，導致MODS〔1〕，其發(fā)展過程較好地模擬了臨床MODS的所謂“雙相打擊”病程。研究結(jié)果顯示，正常組動物血清未檢測到MIF的存在;動物致傷后12 h，血清中MIF水平開始上升，傷后1～2 d達到高峰，隨后下降，傷后10 d再次顯著升高。這一規(guī)律與動物全身性炎癥反應的程度及預后密切相關;血清MIF第一個高峰，動物處于過度炎癥反應階段，血清MIF來源于組織和外周血單核巨噬細胞分泌〔2〕，以及組織細胞損傷釋放〔3〕;血清 MIF第二次升高時，動物正值MODS期，此時機體免疫機能低下，大量的組織細胞壞死，因此血清MIF的升高可能源自壞死細胞的釋放〔4〕。血中大量的MIF將對血中和各組織器官中的免疫細胞和實質(zhì)細胞產(chǎn)生廣泛的影響〔5～9〕。

抗原提呈細胞表面MHC-Ⅱ類分子表達量的多少直接反映了其提呈抗原的能力，從而決定了T細胞的活化水平和免疫應答能力〔10〕。本研究提示MIF對MODS小鼠預后的影響與其抑制抗原提呈細胞MHC-Ⅱ類分子表達、抑制細胞免疫應答能力，導致免疫失衡有關。本研究結(jié)果表明，在MODS病程的早期采用抗MIF治療，可以通過改善抗原提呈細胞的功能和T輔助細胞亞群的比例，調(diào)節(jié)機體免疫平衡，阻止免疫失衡的發(fā)生，進而阻止MODS的發(fā)生和發(fā)展。

有研究認為，MIF是通過抑制皮質(zhì)類固醇激素對胞液IκB表達的上調(diào)對抗皮質(zhì)類固醇等炎癥因子的分泌，從而抵抗皮質(zhì)類固醇激素在 NF-κB/IκB 信號轉(zhuǎn)換通路中的效應〔6〕。NF-κB是普遍存在于免疫細胞胞液中的轉(zhuǎn)錄因子，可被炎癥刺激(細胞因子、LPS、病毒)活化。當炎癥刺激與其受體結(jié)合，即可激活細胞內(nèi)一系列磷酸化反應，導致IκB分裂崩解，而IκB是一種阻礙蛋白，能阻礙NF-κB的釋放。一旦 IκB崩解，NF-κB即釋放活化，轉(zhuǎn)移至胞核中激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。皮質(zhì)類固醇激素通過與胞液中的受體結(jié)合為復合物，轉(zhuǎn)移到核中，促進IκB的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥介質(zhì)的釋放。而大量的IκB可限制NF-κB于胞液中，阻止炎癥介質(zhì)基因的表達。研究者在實驗中運用LPS刺激人外周血單核細胞可引起胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA結(jié)合力上升。在細胞培養(yǎng)液中加入生理劑量的潑尼松(50～200 ng/ml)可降低LPS的該種效應。即潑尼松可上調(diào)IκB的表達，抑制NF-κB。而當再加入1 ng/ml的MIF時則可抑制潑尼松的效應，使得胞液中IκB水平下降及核中NF-κB DNA結(jié)合力上升。在無LPS的情況下，MIF也同樣可抑制潑尼松誘導的IκB的升高。說明了MIF抵消皮質(zhì)類固醇激素的作用可能是阻止了潑尼松引起的IκB合成的增多，從而阻斷了其對炎癥因子表達的限制。

MIF是炎癥免疫反應中的重要細胞因子，雖然近來已有一些研究證實了MIF在炎癥反應中某些方面的作用機制〔11〕，還需要更多的研究去發(fā)現(xiàn)其完整的作用機制。一旦明確了MIF的作用機制，可有助于合理調(diào)節(jié)機體的免疫反應，在機體需要免疫反應時增強MIF的作用以殺滅病原菌，反應過度時則抑制其作用以防出現(xiàn)全身性炎癥反應綜合征，以抵抗疾病，維持機體健康，同時還可實現(xiàn)對皮質(zhì)類固醇激素更合理的使用。

1 孫 宇，陸江陽，王曉虹，等.小鼠遲發(fā)性多器官功能障礙綜合征模型復制及病理學觀察〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學，2003;15(1):15-8.

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3 Shapiro N，Howell MD，Bates DW，et al.The association of sepsis syndrome and organ dysfunction with mortality in emergency department patients with suspected infection〔J〕.Ann Emerg Med，2006;48(5):583-90.

4 Watson RS，Careillo JA，Linde-Zwirble WT，et al.Epidemiology of severe sepsis in children in the United States〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2003;167(5):695-701.

5 Bernhagen J，Calandra T，Mitchell RA，el al.MIF is a pituitary derived cytokine that potentates lethal endotoxaemia〔J〕.Nature，1993;365(6448):756-9.

6 Daun JM，Cannon JG.Macrophage migration inhibitory factor antagonizes hydrocortisone-induced increases in cytosolic I kappaB-alpha〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2000;279(3):R1043-9.

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10 Glimcher LH，Kara CJ.Sequences and factors:a guide to MHC class-Ⅱtranscription〔J〕.Ann Rev Immunol，1992;10(1):13-49.

11 張振輝，林碾儀，陳曉輝，等.巨噬細胞移動抑制因子在膿毒癥小鼠心和腎組織中的表達〔J〕.中華急診醫(yī)學雜志，2009;12(1):68.