王曉映 劉 鵬 朱 華 徐艷峰 馬春梅 代小偉 劉 穎 秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因，其特征性的病理改變是在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。目前，AD的發(fā)病機制仍然不明確，一些研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的異常可能在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。本實驗以APPswe/PSΔE9模型小鼠作為研究對象，探討AD中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠的建立 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所構(gòu)建并提供〔1〕。APPswe轉(zhuǎn)基因編碼一段人鼠嵌合的蛋白，其中APP的胞外和胞內(nèi)區(qū)域為鼠源性序列，而Aβ結(jié)構(gòu)域為人源性序列并包含瑞士突變K594N/M595L。PSΔE9轉(zhuǎn)基因編碼人源性E9外顯子缺失的PS1。轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織及鼠尾，用堿裂解法提取基因組DNA，PCR分別檢測APPswe及 PSΔE9基因的表達(dá)。APP基因 PCR產(chǎn)物長344 kb，PS基因PCR產(chǎn)物長608 kb。

1.2 Western印跡法檢測bcl-2、caspase-9以及活化caspase-3的表達(dá) 將小鼠脫頸處死后，迅速取出其腦組織，用生理鹽水洗去血液，立即置于RIPA蛋白裂解液中，提取總蛋白。蛋白濃度用BCA法進(jìn)行測定。蛋白上樣量為40 μg，利用12%的SDSPAGE膠進(jìn)行分離，然后將其轉(zhuǎn)移至NC膜(Millipore)上，室溫下封閉 1 h，與 bcl-2(Abcam)、capase-9(Millipore)及 caspase-3(Abcam)抗體進(jìn)行雜交，4℃過夜，用TBST洗膜3次，與辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和GAPDH進(jìn)行雜交，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。用t檢驗對Western印跡的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠鼠尾DNA鑒定結(jié)果 裂解鼠尾后提取DNA，分別用針對APP，PS1的引物進(jìn)行擴增，篩選鑒定陽性小鼠，部分檢測結(jié)果見圖1。

圖1 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠鼠尾DNA PCR鑒定結(jié)果

2.2 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠腦組織中bcl-2蛋白的表達(dá)情況 利用Western印跡的方法分別檢測了3月齡和6月齡小鼠腦組織中bcl-2蛋白的表達(dá)情況，并將檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析。由圖2可以看出，與同月齡的野生型對照小鼠相比，APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠中，bcl-2表達(dá)水平明顯降低。每個月齡均用了12只小鼠，其中6只為模型鼠，6只為同月齡的野生型對照鼠。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，所有實驗均重復(fù)3次。見表1。

圖2 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠腦組織中bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.3 APPswe/PSΔE9轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠腦組織中caspase-3和caspase-9的表達(dá)情況 與對照相比，3月齡和6月齡APPswe/PSΔE9小鼠中活化的caspase-9和caspase-3蛋白水平均升高(圖3)。見表1。

表1 各組小鼠腦組織bcl-2、caspase-3、caspase-9的表達(dá)(n=12，s)

表1 各組小鼠腦組織bcl-2、caspase-3、caspase-9的表達(dá)(n=12，s)

月齡對照組 37.2±2.6 53.7±3.9 20.7±7.3 32.5±11.4 42.3±7組別 bcl-2 3月齡 6月齡caspase-3 3月齡 6月齡caspase-9 3月齡 6.4 52.6±6.3模型組 18.4±4.1 41.8±4.2 39.8±11.7 67.3±11.7 65.4±8.9 77.3±10.5

圖3 APPswe/PSΔE9小鼠和正常對照小鼠中caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)水平

3 討論

AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要疾病，大約有50% ～60%的癡呆癥患者都是由該病所導(dǎo)致的〔2〕。目前，AD的病因尚不明確，因此該病的治療仍然十分困難。關(guān)于AD發(fā)病機制的研究，最初主要集中在APP、PS等單一的基因上，但是隨著研究的不斷深入和進(jìn)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的過程，各種因素(包括異常的凋亡)都有可能參與其中。早在上世紀(jì)90年代，就已經(jīng)有學(xué)者開始研究凋亡與AD的關(guān)系〔3，4〕，而且越來越多的研究表明，異常的凋亡可能在AD的發(fā)生過程中起到非常重要的作用。APP是在阿爾茨海默病發(fā)病機制中被研究最多的一個蛋白，但是它的功能目前仍不明確，新的研究發(fā)現(xiàn)〔5〕，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以影響一些基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元特異性凋亡，這也進(jìn)一步提示我們凋亡在AD的發(fā)病機制中可能具有重要作用。

bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以抑制caspase-3和caspase-9的活化，而后兩者則是凋亡過程中至關(guān)重要的因子。本研究實驗以APPswe/PSΔE9小鼠作為AD的模型，檢測了其腦組織中bcl-2、caspase-3以及caspase-9的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中，bcl-2表達(dá)水平明顯降低，而caspase-3和caspase-9水平則明顯升高，提示在AD中可能存在異常高水平的凋亡。一些研究發(fā)現(xiàn)，bcl-2是AD的一個保護(hù)性因子〔6～9〕，我們的實驗也在一定程度上間接支持了這一觀點。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，caspase活化以后可以導(dǎo)致AD中神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變〔10〕。由此，我們可以看出bcl-2、caspase-3以及caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白與AD的關(guān)系十分密切。我們的實驗還發(fā)現(xiàn)，在3月齡APPswe/PSΔE9小鼠腦組織中就可以檢測到這些凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，這提示我們異常的凋亡可能在AD的早期就已經(jīng)存在，這將有助于我們研究AD早期的發(fā)病機理，為其早期診斷早期治療提供一定的幫助。

1 宗園媛，王曉映，王海林，等.APP/PS雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型的老年斑及行為學(xué)動態(tài)分析〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008;18(9):8-12.

2 Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

3 LaFerla FM，Tinkle BT，Bieberich CJ，et al.The Alzheimer's A beta peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice〔J〕.Nat Genet，1995;9(1):21-30.

4 Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease〔J〕.Neuroreport，1994;5(18):2529-33.

5 Ohkawara T，Nagase H，Koh CS，et al.The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis〔J〕.Gene，2011;475(1):1-9.

6 Saillé C，Marin P，Martinou JC，et al.Transgenic murine cortical neurons expressing human Bcl-2 exhibit increased resistance to amyloid beta-peptide neurotoxicity〔J〕.Neuroscience，1999;92(4):1455-63.

7 Song YS，Park HJ，Kim SY，et al.Protective role of Bcl-2 on beta-amyloidinduced cell death of differentiated PC12 cells:reduction of NF-kappaB and p38 MAP kinase activation〔J〕.Neurosci Res，2004;49(1):69-80.

8 Ferreiro E，Eufrásio A，Pereira C，et al.Bcl-2 overexpression protects against amyloid-beta and prion toxicity in GT1-7 neural cells〔J〕.J Alzheimers Dis，2007;12(3):223-8.

9 Rohn TT，Vyas V，Hernandez-Estrada T，et al.Lack of pathology in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease after overexpression of the anti-apoptotic protein Bcl-2〔J〕.J Neurosci，2008;28(12):3051-9.

10 de Calignon A，Spires-Jones TL，Hyman BT.Caspase activation precedes and leads to neurodegeneration in a murine model of Alzheimer's disease〔J〕.Med Sci(Paris)，2010;26(10):787-9.