王 宇 張明艷 王 燕 王 波 趙永才 (河北大學基礎醫(yī)學院，河北 保定 07000)

血管性癡呆(VD)是老年期癡呆的主要原因(約占80%)〔1〕，表現(xiàn)為高級神經活動的智能障礙，特別是認知功能障礙，如學習、記憶、思維等障礙，以及失語、失認等神經心理學癥狀、體征;重者需要依賴他人照顧，給家庭和社會帶來巨大負擔。VD模型的病理學研究顯示，慢性低灌注導致神經元凋亡、缺失，導致突觸數(shù)量減少，這可能是出現(xiàn)學習記憶障礙的原因之一〔2〕。有報道VD模型小鼠學習記憶能力下降可能與海馬突觸后致密物95(PSD-95)的表達減少有關〔3〕。近幾年銀杏葉提取物改善VD患者學習記憶的報道較多，但其具體機制不清楚。本文通過研究銀杏葉提取物對大鼠海馬PSD-95表達的影響，旨在探索其治療VD的療效及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 采用純種雄性Wistar大白鼠60只，體質量220～280 g(河北醫(yī)科大學實驗動物中心供給)。隨機分為模型組，干預組，假手術組和正常組，每組15只。(1)模型組，制備VD大鼠模型;(2)干預組，制備VD大鼠模型，并在造模前5 d開始給予銀杏葉提取物(100 mg/kg)，于清晨一次性注射給藥，每日一次，直到處死前1 d;(3)假手術組，大鼠進行雙側頸動脈分離;(4)正常組，不做特殊處理。造模14 d后用水迷宮實驗測定各組大鼠的學習、記憶功能，將大鼠斷頭取海馬做下一步實驗。

1.2 方法

1.2.1 VD模型制備 采用張麗香等〔4〕的方法，首先將大鼠用水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥固定于操作臺，常規(guī)消毒后作約1 cm長的頸部正中切口，暴露并分離雙側頸總動脈，游離后置線，套活扣，拉緊絲扣，阻斷血流10 min后松開，恢復血流灌注10 min，如此重復3次，同時在距離尾尖1 cm處剪斷放血約1 ml后熱凝止血;第三次再灌注后觀察30 min，縫合切口。術后切口局部注射慶大霉素2 000 U，給予青霉素肌肉注射2 000 U/d，連續(xù)3 d觀察大鼠存活情況，實驗結束后大鼠全部存活。

1.2.2 試劑 凋亡TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司，兔抗PSD-95抗體購自美國abcam公司，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自美國Thermo公司，鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 采用一個直徑1.2 m、高0.5 m的圓桶，劃為四個象限，盛水后按0.5% ～1.5%比例加入奶粉，使水成不透明乳白色，水溫控制于22℃ ～25℃。將一直徑10 cm的平臺固定于某一象限，平臺在水平面下1 cm。麻醉后16 d開始水迷宮實驗。程序包括:①定位航行實驗，歷時5 d，每天上、下午各4次，將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中，記錄2 min內尋找平臺的時間(逃避潛伏期);②空間探索試驗，將鼠任選一入水點放入水中，測其2 min內在原平臺處的停留時間。整個認知功能測試過程中，保持實驗室內燈光、物品擺放等室內環(huán)境一致，以排除環(huán)境干擾。

1.2.4 組織取材、海馬總蛋白提取與Western印跡的測定 反應認知功能測試完畢后大鼠快速斷頭，取出腦組織并分離海馬。(1)提取海馬總蛋白并用BCA法進行蛋白定量，其蛋白含量在5～8 mg/ml之間。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳:配制12%分離膠和5% 濃縮膠，每孔加樣20 μl，電壓110 V進行電泳。(3)轉膜:恒流275A。(4)抗原抗體反應及顯色。應用quantity one軟件，以目的條帶PSD-95與內參照GAPDH的平均光密度的比值表示PSD-95蛋白水平，進行半定量分析。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 參照試劑盒說明書進行。

1.2.6 結果觀察 用1%抗體稀釋液替代兔抗PSD-95抗體進行陰性對照，反應呈陰性。在Olympus顯微鏡40倍鏡下，利用Image-Pro Plus Version 5.0彩色圖像分析系統(tǒng)計數(shù)TUNEL及PSD-95免疫陽性細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示。

2 結果

2.1 行為學檢測 水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的逃逸潛伏期均明顯高于假手術組(P＜0.05)，大鼠常在四個象限無目的漫游，尋找到平臺的時間較長，經訓練提高較慢，提示模型大鼠存在學習記憶障礙。與模型組相比，干預組大鼠逃逸潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，但仍長于假手術組(P＜0.05)。假手術組和正常組大鼠之間無顯著差異，各組游泳速度無明顯差異。見表1。

表1 各組大鼠游泳速度及逃逸潛伏期比較(s)

表1 各組大鼠游泳速度及逃逸潛伏期比較(s)

與模型組比較:1)P＜0.05;與假手術組比較:2)P＜0.05

組別 游泳速度(cm/s)逃逸潛伏期(s)模型組11.50±3.10 29.26±4.28 13.60±2.30 51.09±3.10干預組 12.60±3.10 39.14±6.101)2)假手術組 12.40±3.20 28.43±5.191)正常組

2.2 大鼠海馬組織神經元凋亡情況 光鏡下觀察，TUNEL染色大鼠海馬CA1及CA3區(qū)陽性凋亡神經元細胞核呈棕黃色，神經元體積縮小，呈三角形或扇形，尼氏小體消失。核固縮深染，核內染色質濃縮，染色質濃集于核周，呈新月形、環(huán)形甚至形成碎片。陰性神經元的核周圍不顯示黃色，神經元形態(tài)正常，較易區(qū)別。正常組和假手術組大鼠海馬組織中只有零星凋亡神經元〔(4.26±1.38)%，(5.43±2.19)%〕，干預組〔(19.14±5.15)%〕有部分凋亡神經元，而模型組大鼠海馬可見大量凋亡神經元〔(31.09±3.63)%〕，成簇出現(xiàn)，與假手術組及正常組相比有明顯統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與干預組相比也有顯著差異(P＜0.05)。

2.3 Western印跡分析銀杏葉提取物對海馬組織PSD-95蛋白表達水平的影響 模型組大鼠海馬PSD-95蛋白明顯降低，與假手術組比較差異顯著(P＜0.01);干預組PSD-95蛋白明顯增加，與模型組比較差異顯著(P＜0.01)。見圖1。

圖1 Western印跡顯示大鼠海馬PSD-95蛋白表達水平

3 討論

海馬是與學習、記憶、情感等功能密切相關的重要腦皮層區(qū)，直接參與信息的存儲和處理。海馬神經元的存活數(shù)量直接影響神經元突觸的可塑性效應，從而影響對信息的處理和傳遞〔4〕。有研究表明，腦神經元特別是海馬組織對缺血極其敏感，極易引起神經元損傷凋亡〔5〕，其中海馬CA1、CA3和門區(qū)的抑制性中間神經元是海馬結構內最易受損的部位。因此海馬組織神經元的大量凋亡丟失，可能是老年腦卒中患者發(fā)生VD的病理基礎。

本研究表明，模型組大鼠海馬組織存在大量神經元凋亡，雖然干預組大鼠海馬組織亦有部分神經凋亡，但與模型組相比明顯減少，表明銀杏葉提取物可明顯預防腦缺血誘導的海馬神經元凋亡，減輕缺血對海馬組織造成的損傷，甚至可以避免腦卒中患者發(fā)展為VD。中樞神經系統(tǒng)突觸后膜細胞質面的PSD是突觸后信號傳導和整合的結構基礎，密切參與突觸功能的調節(jié)和突觸后神經元對興奮性刺激反應的調控，包含各種受體蛋白、錨定蛋白以及信號蛋白等，其中受體蛋白及其下游信號分子常結合于共同的錨定蛋白，組裝為蛋白信號復合體，以利于突觸后信號快速且特異性傳遞。PSD-95是該區(qū)域的錨蛋白，其主要功能為調節(jié)突觸功能以及發(fā)揮突觸和下游信號通路聯(lián)系作用，并參與突觸的功能和活性的動態(tài)調節(jié);在缺氧引起神經元損傷病變中，也涉及到PSD-95表達改變〔6〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧性腦損傷導致大鼠PSD-95表達降低同時大鼠學習記憶障礙，而其蛋白水平在干預組較模型組大鼠明顯升高，提示PSD-95表達下調可能是誘導缺氧后VD發(fā)作的分子機制，海馬PSD-95表達增多可能有助于降低大鼠VD的發(fā)生。銀杏葉提取物可能通過影響神經元結構蛋白PSD-95表達來抑制神經元凋亡。

1 Gold G，Kovari E.Vascular dementia:big effects of small lesions〔J〕.Rev Med Suisse，2011;7(316):2190，2192-3.

2 Kawahara M，Konoha K，Nagata T，et al.Protective substances against zinc-induced neuronal death after ischemia:carnosine as a target for drug of vascular type of dementia〔J〕.Recent Pat CNS Drug Discov，2007;2(2):145-9.

3 Yao WD，Gainetdinov RR，Arbuckle MI，et al.Identification of PSD-95 as a regulator of dopamine-mediated synaptic and behavioral plasticity〔J〕.Neuron，2004;41(4):625-38.

4 張麗香，藺心敬，李呂力，等.血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡與乙酰膽堿含量變化〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(24):3222-4.

5 McEwen BS.Physiology and neurobiology of stress and adaptation:central role of the brain〔J〕.Physiol Rev，2007;87(3):873-904.

6 Chen WF，Chang H，Huang LT，et al.Alterations in long-term seizure susceptibility and the complex of PSD-95 with NMDA receptor from animals previously exposed to perinatal hypoxia〔J〕.Epilepsia，2006;47(2):288-96.