侯 棟，李 曄，王 洋，潘玉雷，崔 同

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定071000

原花青素(proanthocyanidins，簡(jiǎn)稱PC)是一種能在酸性條件下加熱分解產(chǎn)生花色素的縮合多酚類次生代謝產(chǎn)物，存在于山楂、葡萄、松樹(shù)、高粱、蘋(píng)果、紅景天、可可、白樺等多種藥用、食用植物組織中。大量研究表明，PC 是一種性能優(yōu)異的天然抗氧化劑和自由基清除劑［1，2］，具有保護(hù)心腦血管、抗炎、抗輻射、降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)等一系列重要生理作用，是一種重要的天然產(chǎn)物資源。

PC 常以黃烷-3-醇類為主要結(jié)構(gòu)單元，通過(guò)4→8 位或4→6 位連接，聚合成十分復(fù)雜的混合物，不同植物來(lái)源、鍵合方式、聚合程度、加工提取方法等因素都會(huì)影響PC 產(chǎn)品的組成和含量，從而影響產(chǎn)品的保健功效。因此，如何準(zhǔn)確客觀地表征和分析PC 的組成和含量，一直是制約PC 產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化的重要問(wèn)題。

目前PC 行業(yè)使用最廣泛的分析方法是分光光度法，如香草醛-鹽酸法［3］、Bate-Smith 法［4］、Porter法［5］等。這些方法包括目前國(guó)標(biāo)方法的缺陷在于，以某種指定對(duì)照品進(jìn)行的分析，其結(jié)果不能準(zhǔn)確反映不同來(lái)源PC 含量的真實(shí)差異。HPLC 法［6］包括液譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)［7］雖然能對(duì)PC 的主要成分直接進(jìn)行分離和定量分析，但由于PC 組成十分復(fù)雜，目前除幾種小分子PC 成分之外，其余PC 純品很難從市場(chǎng)上獲得，并且HPLC 法也很難對(duì)所有PC 成分實(shí)現(xiàn)徹底分離。

Thompson 等［8］曾發(fā)現(xiàn)，在有親核試劑例如芐硫醇存在下，PC 可在酸性條件下熱分解，基部單元生成相應(yīng)的黃烷醇分子，上部的其余單元生成相應(yīng)的芐硫醚衍生物。這便可以使組成十分復(fù)雜的PC 混合物經(jīng)硫解反應(yīng)后只生成有限幾種反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)分析這些產(chǎn)物的含量不僅可以獲得樣品中PC 總含量的結(jié)果，而且可以通過(guò)芐硫醚衍生物總含量與黃烷醇含量的比例關(guān)系，計(jì)算出樣品中PC 成分的平均聚合度。目前這種方法多應(yīng)用于PC 成分的結(jié)構(gòu)鑒定，以及一些初步的HPLC 定量分析法［9］。本項(xiàng)研究擬在此基礎(chǔ)上，通過(guò)制備和純化PC 的芐硫醚衍生物，并以此為對(duì)照品，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，開(kāi)發(fā)一種新型的硫解-HPLC 快速分析方法，以便實(shí)現(xiàn)PC含量和平均聚合度的同時(shí)檢測(cè)，為PC 類植物提取物的產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1 儀器

定量分析用HPLC:Agilent 1200 型(安捷倫公司，美國(guó)加州帕羅阿托市)，由在線脫氣機(jī)，低壓梯度四元輸液泵，Agilent Chemstation 色譜工作站，光電二極管陣列檢測(cè)器，CO-3010 柱恒溫控制箱(天津美瑞泰克科技有限公司生產(chǎn))，及Hypersil BDS C18(100 mm × 2.1 mm i.d.，3 μm)色譜柱組成。

制備HPLC(大連依利特科學(xué)儀器有限公司，大連):由P260 型輸液泵，紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，Echrom 2000 色譜工作站組成，配用SinoChrom ODS-BP C18(20.0 mm × 300 mm id，10 μm )以及SinoChrom SiO2(20.0 ×250 mm id，10 μm)制備色譜柱。

LC-MS 系統(tǒng):LTQ 型，美國(guó)賽默飛世爾(Thermo Fisher)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 材料

葡萄籽提取物(標(biāo)示含量＞95%)，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。山楂，2011 年6 月23 日采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園。

1.3 試劑

沒(méi)食子酸(gallic acid，簡(jiǎn)稱GA)，表兒茶素(epicatechin，簡(jiǎn)稱EC)，兒茶素(catechin，簡(jiǎn)稱CT)購(gòu)于Sigma 公司。芐硫醇購(gòu)于Fluka(Buchs，Switzerland)公司;表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechin gallate，簡(jiǎn)稱ECG)購(gòu)于上海同田生物科技有限公司。色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)于Honeywell Burdick ＆ Jackson 公司。表兒茶素-4-苯甲硫醚(EC-S)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯-4-苯甲硫醚(ECG-S)按下列方法制備:取葡萄籽提取物2 g 溶解于3 mL 甲醇，吸取500 μL 上清液，加入500 μL 含30%芐硫醇的乙醇溶液和250 μL 冰乙酸:1M 鹽酸(50:1，v/v)溶液混合，密封后在90℃反應(yīng)60 min。然后將硫解產(chǎn)物混合液用反相制備HPLC 反復(fù)進(jìn)樣分離純化，色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18(300 mm×20 mm id，10 μm )，流動(dòng)相為70%甲醇(含0.05%甲酸)，流速10 mL/min，在280 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)流出物，收集目標(biāo)餾分于40 ℃減壓濃縮除去甲醇，再用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮。然后用SinoChrom SiO2(250 ×20 mm id，10 μm)正相柱純化，流動(dòng)相:乙酸乙酯∶石油醚(60∶40，v/v)，流速10 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，收集目標(biāo)餾分濃縮至干，最后得到兩種硫醚衍生物純品。經(jīng)LC-MC 分析，其質(zhì)譜信息與EC-S 和ECG-S 的結(jié)構(gòu)吻合(見(jiàn)圖2)，其色譜保留行為與文獻(xiàn)報(bào)道一致。其余試劑為分析純。

1.4 樣品前處理

取山楂青果，去籽去梗后切碎混勻，精確稱取5 g 至研缽，加入20 mL 95%乙醇溶液(含0.2% Vc，0.2%磷酸)后研磨至粥狀，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，超聲提取10 min，用70% 乙醇(含0. 2% Vc，0.2%磷酸)定容至50 mL，混勻、靜置后離心(4000 rpm，10 min)，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，備用。

葡萄籽提取物混勻后精確稱取10 mg，用95%乙醇溶解定容至10 mL，取1 mL 液體用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.5 硫解反應(yīng)

反應(yīng)A 液:5%(v/v)芐硫醇乙醇溶液;反應(yīng)B液:冰醋酸∶1M 鹽酸(50∶1 v/v)。取100 μL A 液，50 μL B 液，100 μL 樣品溶液，放入小瓶中密封，90℃下水浴反應(yīng)60 min 后立即冷卻，用于HPLC 分析。

1.6 HPLC 色譜條件

流動(dòng)相A:0.05%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈∶甲醇(2∶1，v/v);梯度洗脫程序(min/B%):0/6%，4/50%;6/55%;7/100%;8/100%;9/6%;15/6%;柱溫:35 ℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;定量:峰面積外標(biāo)法。

1.7 質(zhì)譜條件

正離子掃描(ESI，m/z 50～1000);毛細(xì)管電壓:33 V;光電倍增器電壓:-1560 V;補(bǔ)償電壓:95 V;離子源溫度:35 ℃;不分流檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫醚衍生物對(duì)照品的LC-MS 分析

采用1.6 和1.7 所述的LC-MS 方法對(duì)這兩種硫醚衍生物進(jìn)行了陽(yáng)離子模式分析，圖1 示這兩種成分的陽(yáng)離子質(zhì)譜圖。

圖1 兩種硫解產(chǎn)物正離子模式質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrums of two Thiolysis Derivatives

圖1 中(A)給出了質(zhì)荷比413 的質(zhì)譜峰，與ECS 的分子離子［M + H］+一致，質(zhì)核比289 的質(zhì)譜峰與EC 碎片離子［M–C7H8S］+一致。因此，質(zhì)譜分析結(jié)果支持其結(jié)構(gòu)為EC-S 的判斷。同理，(B)圖給出了質(zhì)核比為565 的質(zhì)譜峰，它與ECG-S 的分子離子［M + H］+一致，而質(zhì)核比為441 的質(zhì)譜峰與ECG-S 分子去掉硫醚后的ECG 碎片離子［M –C7H8S］+的質(zhì)量一致，質(zhì)譜分析結(jié)果支持其結(jié)構(gòu)為ECG-S 的判斷。

2.2 對(duì)照品貯備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取對(duì)照品GA、CT、EC、ECG、EC-S和ECG-S，用甲醇配制成2 mg/mL 的貯備液，使用前取貯備液用50%甲醇配制相應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法精密度

取2.2 所述對(duì)照品貯備液配制混標(biāo)液，使其中GA、CT、EC、ECG、EC-S 和ECG-S 的濃度分別為160、480、320、160、480 和320 μg/mL，用50%甲醇稀釋1 倍后按1.6 所述HPLC 方法重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積，以評(píng)價(jià)方法的精密度。計(jì)算得6 種對(duì)照品峰面積RSD 分別為1.37%、1.09%、1.60%、0.74%、1.85%和1.86%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.4 線性關(guān)系與檢出限

將混合對(duì)照品溶液用50% 甲醇逐級(jí)稀釋，按1.6 所述HPLC 方法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以峰面積(mAU·S)為縱坐標(biāo)，以其進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以3 倍信噪比(S/N)時(shí)的進(jìn)樣量確定最低檢出限。求得6 種對(duì)照品的線性回歸方程、線性回歸系數(shù)、最低檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，響應(yīng)值與進(jìn)樣量之間具有良好線性相關(guān)性，線性范圍至少320 倍，最低檢出限在ng 數(shù)量級(jí)，可以滿足常規(guī)樣品的定量分析。

表1 對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及最低檢出限Table 1 Regression equation，correlation coefficient，linear range and the minimum detection limit

2.5 加標(biāo)回收率分析

采用加標(biāo)回收率法對(duì)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行了評(píng)估。重復(fù)精確稱取葡萄籽提取物樣品40 mg，溶于10 mL 甲醇溶液中，按照1.5 所述的硫解衍生反應(yīng)進(jìn)行處理，再按1.6 所述的方法逐個(gè)進(jìn)樣分析，統(tǒng)計(jì)各成分的分析結(jié)果，計(jì)算各成分含量的平均值。然后另取5 份樣品，每份中均添加含有GA、CT、EC、ECG 的混合對(duì)照品，四種成分的加標(biāo)水平分別為5，65，20 和10 mg/g(干重)。按照1.5 所述的硫解衍生反應(yīng)進(jìn)行處理，再按1.6 所述的方法逐個(gè)進(jìn)樣分析，統(tǒng)計(jì)各成分的分析結(jié)果，計(jì)算各成分的加標(biāo)回收率及其RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表2。由表中可以看出，CT、EC、ECG 的回收率較高，而GA 的平均回收率偏低，推測(cè)GA 比較活潑，在衍生反應(yīng)過(guò)程中存在某種影響因素。

表2 各成分回收率Table 2 Recoveries of gallic acid，catechin，epicatechin and epicatechin gallate

2.6 樣品分析

將混合對(duì)照品液按1.6 所述方法進(jìn)樣HPLC 分析，實(shí)際樣品按1.4 所述方法進(jìn)行樣品前處理，按1.5 所述方法進(jìn)行硫解并按1. 6 所述方法進(jìn)行HPLC 分析，典型的色譜圖如圖2 所示。從圖2(A)可以看出，6 種對(duì)照品可在11 min 以內(nèi)完成分離，比以往的方法更快捷。從圖2(B)圖2(C)中可以看出，葡萄籽提取物和山楂樣品經(jīng)過(guò)硫解反應(yīng)之后色譜圖變得非常簡(jiǎn)單，除本試驗(yàn)選用的6 種主要對(duì)照品之外，其它只在8 min 和10 min 之間有3 個(gè)含量不高的未知成分，而原來(lái)聚集在6～10 min 處的高分子聚合物雜質(zhì)的大峰已基本消除，這使得PC 的定量分析結(jié)果變得更加準(zhǔn)確可靠，不同植物來(lái)源的PC 之間的比較也變得更加簡(jiǎn)單可信。結(jié)果表明，不同植物來(lái)源的PC，其單體組成差異很大，例如山楂果實(shí)的PC 中不含GA、CT 和ECG，因此圖譜顯得更加簡(jiǎn)單。

圖2 對(duì)照品(A)、山楂硫解樣品(B)及葡萄籽提取物硫解樣品(C)的HPLC 圖Fig.2 HPLC profiles (detected at 280 nm)of reference standards (A)，HPLC traces of polymeric proanthocyanidins from immature Chinese hawthorn (B)after thiolysis and HPLC traces of polymeric proanthocyanidins from grape seed extracts after thiolysis (C)including gallic acid，flavan-3-oL and their relational thiolysis derivatives

兩份實(shí)際樣品經(jīng)過(guò)硫解-HPLC 分析，代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得結(jié)果如表3。從表3 可以看出，山楂青果中其PC 含量很高，為38.42 mg/g。葡萄籽提取物中PC 含量為427.2 mg/g。

2.7 平均聚合度的計(jì)算

根據(jù)PC 硫解反應(yīng)原理［8］可知，樣品經(jīng)過(guò)硫解反應(yīng)后，其末端生成黃烷醇單體，而上部的其余各單元均生成相應(yīng)的芐硫醚衍生物。因此，以GA、CA、EC、ECG、EC-S、ECG-S 這些化合物為對(duì)照品，可以對(duì)樣品中所含原花色素總量進(jìn)行測(cè)定。樣品中PC的平均聚合程度(mDP)則可以由硫解反應(yīng)液中生成的所有黃烷醇單體的總濃度除以所生成的末端黃烷醇單元濃度之比來(lái)計(jì)算。即:按以下公式計(jì)算:

表3 實(shí)際樣品PC 含量(mg/g)Table 3 Contents of PC constitutes in two tested samples

(1)式中:

CCA——兒茶素的摩爾濃度;

CEC——表兒茶素的摩爾濃度;

CECG——表兒茶素沒(méi)食子酸酯的摩爾濃度;

CEC-S——表兒茶素芐硫醚衍生物的摩爾濃度;

CECG-S——表兒茶素沒(méi)食子酸酯芐硫醚衍生物的摩爾濃度。

由表3 的分析結(jié)果計(jì)算得出各成分的摩爾濃度，帶入式(1)即可求出樣品中PC 的平均聚合度。山楂青果和葡萄籽提取物的平均聚合度分別為2.97 和4.83。有研究結(jié)果表明，只有PC 單體和二聚體能夠被人體小腸的細(xì)胞吸收，而三聚體以上的聚合PC 一般不能被人體直接吸收，因此，PC 的平均聚合度是評(píng)價(jià)PC 質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，采用本研究的芐硫醇酸解條件可以使樣品中的聚合PC 分子降解為黃烷醇單體或相應(yīng)的硫醚衍生物，再用HPLC 法實(shí)現(xiàn)了6 種硫解產(chǎn)物在11 min 內(nèi)的快速分離，15 min 完成一次樣品分析，方法具有良好的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。這種方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在提供PC 總含量結(jié)果的同時(shí)還能給出樣品中PC 成分平均聚合度的重要信息，為PC 產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的分析手段。本項(xiàng)研究的另一個(gè)特點(diǎn)是制備純化了兩種黃烷醇的硫醚衍生物并以此作為HPLC 分析的外標(biāo)對(duì)照品。本方法與以往的分光光度法原理不同，兩者的分析結(jié)果可能會(huì)有差異，這方面還需要開(kāi)展大量的分析驗(yàn)證研究。

1 Lv LS(呂麗爽)，Cao D(曹棟).Study on the antioxidant activity of oligermeric proanthocyanidins.Food Sci Technol(食品科技)，2000，4:41-42.

2 Zhu JR(朱婧蓉)，Wang ZM(王忠民)，Li JY(李謹(jǐn)瑜)，et al.Study on the antioxidant activity of oligermeric proanthocyanidins.Food Nut Chin(中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng))，2007，4:34-37.

3 Yao K(姚開(kāi))，He Q(何強(qiáng))，Lv YP(呂遠(yuǎn)平)，et al.Determination of proanthocyanidin from grape-seed extracts. J Food Fer Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2002，28(3):17-19.

4 Bate-Smith EC. Phytochemistry of proanthocyanidins. Phytochemistry，1975，14:1107-1113.

5 Porter LJ，Hrstich LN，Chan BG.The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphindin.Phytochemistry，1986，25:223-230.

6 Svedstrom U，Vuorela H，Kostiainen R. High-performance liquid chromatographic determination of oligomeric procyanidins from dimers up to the hexamer in hawthorn.J Chromatogr A，2002，968:53-60.

7 Fulcrand H，Remy S，Souguet JM. Study of wine tannin oligomers by on-line liquid chromatography electro-spray ionization mass spectrometry. J Agric Food Chem，1999，47:1023-1028.

8 Thompson RS，Jacques D，Haslam E，et al.Plant proanthocyanidins.part I. introduction;the isolation，structure，and distribution in nature of plant procyanidins. JCS Perkin I ，1972，1387-1399.

9 Morimoto S，Nonaka G-I，Nishioka I. Tannins and related compounds. XLI. Isolation and characterization of novel ellagitannins，punicacorteins A，B，C，and D，and punigluconin from the bark of Punica granatum L. Chem Pharm Bull，1986，34:656-663.