段冰玉 周厚綸 任航空

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系，武漢430030）

脊髓損傷是一種常見且后果極其嚴重的疾病，是一種能被促炎性因子誘導(dǎo)繼發(fā)性損傷聯(lián)級的綜合性疾?。?］。大部分的損傷是一些繼發(fā)性損傷，這些繼發(fā)性損傷為緩解疾病提供了一個時間窗以阻止損傷的蔓延。傳統(tǒng)的康復(fù)訓(xùn)練結(jié)合藥物治療，雖然能在一定程度上改善患者的肢體功能［2］，但恢復(fù)效果仍不明顯。已有越來越多的報道證實脊髓損傷的治療與神經(jīng)再生有密切的關(guān)系［3］。神經(jīng)營養(yǎng)因子家族腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）以及神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT－3）在體內(nèi)以及離體情況下，具有維持正常神經(jīng)元的發(fā)育存活及其功能的重要作用［4］。這些營養(yǎng)因子對損傷后的神經(jīng)修復(fù)包括軸突再生都有著支持作用，因此，上調(diào)保神經(jīng)營養(yǎng)因子已成為研究脊髓損傷治療方法的新方向。米諾環(huán)素是第二代半合成四環(huán)素類衍生物，它已被報道具有許多其他的作用，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護功能，有動物實驗顯示米諾環(huán)素可以抑制細胞凋亡過程中凋亡因子半胱天冬酶－1（caspase－1）以及caspase－3，也可以抑制誘導(dǎo)的NO合酶產(chǎn)生NO，并且可以減弱小膠質(zhì)細胞的活化［5］。而在不完全脊髓損傷后，同樣發(fā)生細胞凋亡，因此運用米諾環(huán)素治療不完全脊髓損傷是有改善作用的。

然而，關(guān)于米諾環(huán)素治療不完全脊髓損傷過程中通過增強保護性的因素，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子家族從而促進神經(jīng)修復(fù)以及軸突再生這方面的機制的報道很少見。本實驗著重于評估大鼠不完全脊髓損傷后，運用米諾環(huán)素治療對大鼠運動神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，以及對BDNF和NT－3產(chǎn)生的影響。

材料和方法

1、實驗動物以及分組

54只健康成年雌性SD大鼠（同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），體重180g－210g。兔抗BDNF、兔抗NT－3、米諾環(huán)素（ABcom 公司），RT－PCR 試劑盒（Fermentas公司），引物（上海生工生物技術(shù)有限公司），50kb的DNA ladder、ABC試劑盒（中杉金橋公司），其余均為國產(chǎn)試劑分析純。PCR儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，低溫高速離心機，冰凍切片機。

2、動物分組，模型制備

隨機將動物分成空白對照組、生理鹽水組、米諾環(huán)素治療組三組，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打開椎管，暴露脊髓，用克氏針擊打脊髓，模型成功的標志是，麻醉清醒后，大鼠的雙下肢不能夠大幅度地活動?？瞻讓φ战M僅僅咬開椎板，不進行損傷。米諾環(huán)素組以及生理鹽水組大鼠需要每天早中晚按壓膀胱人工排尿，直至其建立反射性膀胱排空。生理鹽水組和治療組在術(shù)前半小時、術(shù)后1h、術(shù)后24h、48h、72h分別腹腔注射生理鹽水和米諾環(huán)素。

3、行為學(xué)觀察

將各組大鼠分別置于平坦開闊的地面，使其有足夠的空間自由活動，根據(jù)BBB評分進行盲評并記錄。

4、RT－PCR

取每組大鼠8只在術(shù)后3d、7d、14d分別處死各組大鼠，取脊髓組織研磨并提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后擴增并電泳觀察結(jié)果。

5、免疫組化染色

取脊髓組織冰凍切片，DAB進行染色，最后將切片進行脫水透明封片并觀察結(jié)果。

6、圖像處理

PCR結(jié)果用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析并繪圖，免疫組化染色則用IPP圖像分析軟件進行陽性細胞計數(shù)測量。

7、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。

結(jié) 果

1、各組大鼠的行為學(xué)觀察

在三組動物模型中，損傷組（即生理鹽水組）和治療組都存在著下肢功能的缺失。

圖1 三組大鼠的行為學(xué)評分Fig.1 Behavioral scores of three groups of rats

2、逆轉(zhuǎn)錄PCR

損傷組的BDNF和NT－3的mRNA表達較空白組對照組增多，P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義；米諾環(huán)素治療組的BDNF和NT－3進一步增多，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3、免疫組化染色

在各正常對照組，大鼠脊髓的前角運動神經(jīng)元和脊髓后角感覺神經(jīng)元以及部分膠質(zhì)細胞內(nèi)可以見到少量的BDNF和NT－3免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物，其亞細胞定位主要分布于細胞漿中。

討 論

本實驗中，使用改良Allen＇s法損傷脊髓，模型成功后大鼠雙下肢不能活動和負重，然后進行治療，根據(jù)行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在治療組中，大鼠后肢功能顯著恢復(fù)，而生理鹽水損傷組中，隨著時間的持續(xù)，后肢功能有輕度的恢復(fù)，但是表現(xiàn)極不明顯，一般不能負重。

在成年大鼠脊髓，BDNF和NT－3主要分布于灰質(zhì)，特別是前角運動神經(jīng)元。二者對腹角運動神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的存活功能正常發(fā)揮有重要作用。一般正常成年大鼠脊髓中極少含BDNF的mRNA，而損傷后機體自身產(chǎn)生保護性因子出現(xiàn)BDNF的mRNA，在治療組中BDNF的mRNA表達比損傷組要多。同時治療組中脊髓前角處的BDNF和NT－3的陽性細胞比損傷組陽性細胞數(shù)量顯著增多。這兩項都表明，使用米諾環(huán)素治療后的大鼠脊髓中存在一定的反應(yīng)使得神經(jīng)保護性因子BDNF和NT－3表達增多［6］。這種脊髓損傷后大鼠體內(nèi)應(yīng)激性的神經(jīng)因子陽性表達增高有一個自然過程，據(jù)報道7天左右神經(jīng)因子就會降至正常水平［7］。機體在損傷后會自發(fā)的產(chǎn)生一些保護性因子，以減弱損傷，但這種作用還不足以使得機體恢復(fù)到損傷前的狀態(tài)，米諾環(huán)素在這個基礎(chǔ)之上，促進了保護性因子BDNF和NT－3的分泌。

實驗中，我們可以得出米諾環(huán)素在治療不完全脊髓損傷大鼠時能夠上調(diào)BDNF和NT－3的表達。在米諾環(huán)素與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的報道中，還未能發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素治療脊髓損傷后如何上調(diào)神經(jīng)保護性因子BDNF和NT－3，有報道認為在新生大鼠中，BDNF能夠誘導(dǎo)長時程增強（LTP）以及C－纖維的誘發(fā)電位，激活脊髓膠質(zhì)細胞［8］。而已有實驗證實米諾環(huán)素在治療神經(jīng)性疾病過程中抑制小膠質(zhì)細胞的活化，究竟是什么樣的機制還待進一步探究。米諾環(huán)素在不完全脊髓損傷疾病的治療作用是肯定的，且其主要是綜合性作用于各種途徑保護脊髓，促進運動功能恢復(fù)，而不是作用于特定的某類分子。

綜上所述，以前的研究多是集中于米諾環(huán)素的抑制損傷進一步進展的作用，偏重于從這個方面闡述米諾環(huán)素治療神經(jīng)性疾病的機制，而我們在這個實驗中，運用米諾環(huán)素治療明顯上調(diào)了神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的陽性表達，從而進一步保證了研究米諾環(huán)素適用于臨床治療不完全脊髓損傷的進展和前景。

［1］Bareyre FM，Schwab ME.Inflammation，degeneration and regeneration in the injured spinal cord：insights from DNA microarrays.TrendsNeurosci，2003，26：555－563

［2］Baptiste DC，F(xiàn)ehlings MG.Pharmacological approaches to repair the injured spinal cord.J Neurotrauma，2006，23：318－334

［3］Knusel B，Hefti F.K－252b is a selective and nontoxic inhibitor of nerve growth factor action on cultured brain neurons.J Neurochem，1991，57：955－962

［4］Boutros T，Croze E，Yong VW.Interferon－beta is a potent promoter of nerve growth factor production by astrocytes.J Neurochem，1997，69，939－946

［5］Yrjanheikki J，Tikka T，Keinanen R，et al.A tetracycline derivative，minocycline，reduces in ammation and protects against focal cerebral ischemia with a wide therapeutic window.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：13496－13500

［6］Ernfors P，Henschen A，Olson L，et al.Expression of nerve growth factor receptor mRNA is developmentally regulated and increased after axotomy in rat spinal cord motoneurons.Neuron，1989，2（6）：1605－1613

［7］Nakamura M，BregmanBS.Difference in neurotrophic factor Gene expression profiles between neorate and achelt rat spinal cord after injury.Exp Nurol，2001，169（2）：407－415

［8］Li－Jun Zhou，Tao Yang.Brain－derived neurotrophic factor contributes to spinal long－term potentiation and mechanical hypersensitivity by activation of spinal microglia in rat.Brain，behavior，and immunily，2011（25）：322－334