劉梅梅 王 齊 劉曉利 陳曉宇＊

（安徽醫(yī)學高等專科學校組織學與胚胎學教研室，合肥230601；1安徽醫(yī)科大學，合肥230032）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver dieases，NAFLD）已經(jīng)成為一種累及世界范圍內(nèi)大量人群的全球性疾病，在總?cè)巳褐蠳AFLD的患病率已達約20%［1］。NAFLD的確切發(fā)病機制目前仍不清楚，但是炎癥細胞浸潤是NAFLD的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)［2，3］。炎癥反應(yīng)既可以引發(fā)肝細胞脂肪變性、損傷，又會進一步促進氧化和纖維化的進程，因此，抑制炎癥細胞浸潤在NAFLD治療中是非常關(guān)鍵的。甘草酸二銨脂質(zhì)配位體（diammonium glycyrrhizinate lipid ligand，DGLL，天晴甘平）是中藥甘草有效成分的第3代提取物，具有較強的抗炎和保護肝細胞膜以及改善肝功能的作用。以往的藥理實驗證明，DGLL能減輕高脂飲食大鼠引起的肝損傷，降低血清ALT、AST、TC、TG含量，從而起到保護肝臟的作用［4］。我們近來的研究表明，DGLL對于治療高脂飼料誘導大鼠非酒精性脂肪肝中肝臟組織及血清中炎癥因子TNF－α的釋放有明顯的抑制作用，這種抑制作用與其抑制NF－κB炎癥反應(yīng)系統(tǒng)的活化相關(guān)［5］。然而，DGLL對NAFLD過程中炎癥細胞的浸潤是否有抑制作用及其作用機制尚不清晰。本研究通過高脂飼料建立大鼠非酒精性脂肪肝模型，觀察DGLL對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中白細胞浸潤的影響及其內(nèi)在機制。

材料和方法

1.材料

1.1 藥品和試劑 DGLL腸溶膠囊，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司（批號：091205）。聯(lián)苯雙酯片（BDP），北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品（批號：090802）。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠MPO、ICAM－1多克隆一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗均購自Santa Cruz公司。FITC標記的大鼠CD11b和CD18抗體購自BD Biosciences公司。

1.2 動物 Spague－Dawlay（SD）大鼠，雄性，體重180－200 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供（皖醫(yī)實動準第01號）。動物自由進食，飲水，喂標準顆粒飼料，室溫18℃－22℃，常規(guī)飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.3 主要儀器 Leica熒光顯微鏡，德國Leica公司。722S分光光度儀，上海精密科學儀器公司產(chǎn)品。超薄切片機，LKB－NOVA型，瑞典。醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。PowerPac300型電泳儀，美國BIO－RAD公司。FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司。

2.方法

2.1 造模、分組與給藥 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分6組：正常對照組、模型組、DGLL（30、60、120mg／kg）組，陽 性 對 照 藥 BDP（200mg／kg）組［6，7］，每組10只。NAFLD模型的建立參照文獻方法［8］。正常組給予相應(yīng)溶媒，模型組及給藥組均給予高脂乳劑灌胃（10ml／kg）。高脂乳劑灌胃3周后，DGLL干預(yù)組在造模的同時每日灌胃給予相應(yīng)濃度DGLL或BDP 1次，正常組和模型組給予等量生理鹽水。每周稱重一次，相應(yīng)調(diào)整灌胃量。

2.2 樣本采集和處理 實驗6周末禁食12h后股動脈取血，血液以肝素抗凝，用于測定外周血白細胞粘附分子的表達；放血處死動物，迅速取部分肝組織，用于檢測肝組織MPO的活性以及ICAM－1的蛋白表達。

2.3 MPO活性檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測肝臟組織中的 MPO活性，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

2.4 免疫組化染色 取部分受試動物同部位肝組織，置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5μm連續(xù)切片，采用SABC法進行免疫組化染色：3%H2O2溶液處理，熱修復抗原，5%BSA封閉，滴加大鼠MPO單克隆抗體一抗（濃度1∶200），4℃過夜，隔夜滴加生物素化養(yǎng)抗兔IgG二抗，37℃孵育20 min，再滴加試劑SABC，DAB顯色。

2.5 外周血粘附分子檢測 在抗凝缺血中加入FITC標記的大鼠CD11b和CD18抗體（1μg／100μl全血），室溫避光孵育30 min。溶血素溶血，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測，計算單核細胞以及中性粒細胞表面CD11b和CD18的表達量，結(jié)果以平均熒光強度表示［9］。

2.6 Western blot分析 提取肝臟組織總蛋白，采用考馬斯亮藍G－250染色法檢測蛋白含量。用牛血清白蛋白制作標準曲線，測量樣品在595nm處的吸光度，計算各組肝組織總蛋白含量。采用Western blot法檢測肝組織中ICAM－1蛋白的表達。各組以30μg蛋白／泳道上樣，經(jīng)10%SDSPAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1hr，加入小鼠抗大鼠ICAM－1一抗（1∶1000，4℃，過夜）及抗辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（1∶2000）進行雜交，ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，顯影于感光膠片上。另以β－actin作為內(nèi)參，于醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)上分析ICAM－1蛋白表達的相對含量。

結(jié) 果

1.DGLL對高脂乳劑誘導SD大鼠NASH模型肝臟組織MPO表達和活性的影響

免疫組化結(jié)果顯示，肝臟組織MPO蛋白陽性染色呈棕黃色（箭頭所示）。正常組大鼠幾乎沒有MPO蛋白表達，模型組MPO蛋白陽性細胞，比正常組細胞數(shù)明顯增多，染色加深。與NAFLD模型組比較，30、60、120 mg／kg DGLL 組 MPO 蛋白表達隨著劑量的增加而逐漸減弱，200mg／kg BDP組MPO蛋白在肝細胞中表達也減弱，結(jié)果見圖1。與免疫組化結(jié)果相似，相比于正常組，高脂模型組MPO活性同樣顯著升高，而DGLL劑量依賴性地抑制了肝臟組織中 MPO的活性（P＜0.05，圖2）。該結(jié)果表明DGLL可以抑制高脂飲食造成的非酒精性脂肪肝大鼠肝臟組織中炎性細胞的活化和浸潤。

表1 大鼠外周血單核細胞粘附分子表達水平Table 1 The expression of adhesion molecules on rat monocytes

圖4 大鼠外周血粒細胞粘附分子CD11b和CD18峰值圖。Fig.4 Histograms of adhesion molecules CD11b and CD18 expressed on rat neutrophils.

表2 大鼠外周血單核細胞粘附分子表達水平Table 2 The expression of adhesion molecules on rat neuthophils

3.DGLL對高脂乳劑誘導SD大鼠NASH模型肝臟組織中內(nèi)皮細胞粘附分子表達的影響

圖5A為Western blotting檢測肝組織中ICAM－1蛋白表達的結(jié)果。以β－actin為內(nèi)參照，將每組3例樣本目的條帶光密度掃描進行半定量分析，統(tǒng)計結(jié)果見圖5B。相比于正常對照組，高脂模型組ICAM－1的蛋白表達顯著增加（P＜0.05），DGLL治療組劑量依存性的顯著下調(diào)了ICAM－1的蛋白表達（P＜0.05），BDP組ICAM－1的蛋白表達同樣較高脂模型組顯著降低（P＜0.05）。

圖5 大鼠肝臟組織ICAM－1蛋白的表達。與正常組相比＊P＜0.05；＃與模型組相比＃P＜0.05。Fig.5 The expression of ICAM－1 in rat hepatic tissues.＊P＜0.05 vs.control group；＃P＜0.05 vs.model group.

討 論

流行病學調(diào)查表明，NAFLD患病率趨于超越病毒性肝炎和酒精性肝病，已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學問題和社會問題。在NAFLD發(fā)病過程中，肝臟組織中炎性介質(zhì)的釋放和炎性細胞的浸潤是關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)。大量的臨床試驗和動物實驗表明，在NAFLD病人及動物模型中，IL－6、IL－18、C反應(yīng)蛋白以及 TNF－α等炎性介質(zhì)均明顯增加［5，10］，由此引發(fā)的炎性細胞（如白細胞）的活化以及向肝臟組織的浸潤是NAFLD過程中炎癥反應(yīng)加重，進而導致肝臟細胞損傷以及纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11，12］。我們以往的研究表明，DGLL對于NAFLD大鼠模型中肝臟組織及血清中的炎癥因子如TNF－α的釋放有明顯的抑制作用，然而其對白細胞的活化以及組織浸潤的過程是否有改善作用尚未見報道。組織中MPO的表達和活性是白細胞的活化以及組織浸潤的標志物，本研究采用免疫組織化學的方法，證明了DGLL可以抑制高脂飲食誘導的大鼠NAFLD中MPO在肝臟組織的表達。同時，本實驗還用ELISA的方法定量的檢測了肝臟組織中MPO的活性，與免疫組織化學的結(jié)果一致，DGLL顯著地下調(diào)了NAFLD大鼠肝臟組織中的MPO的活性。綜合以上的結(jié)果，本實驗首次證明了DGLL可以抑制高脂飲食誘導的大鼠NAFLD過程中白細胞的活化以及向肝臟組織的浸潤。這為其在臨床中治療NAFLD提供了新的理論依據(jù)。

在NAFLD早期病理過程中，肝臟中的Kuffer細胞被激活，釋放出包括TNF－α在內(nèi)的多種炎性因子［13］，同時，NAFLD 病理過程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放顯著增加，這些炎性介質(zhì)以及ROS均可以通過與白細胞以及內(nèi)皮細胞的相互作用，上調(diào)白細胞與內(nèi)皮細胞表面粘附分子的表達［14］，增強白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，而白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附是白細胞活化進而向組織浸潤的初始環(huán)節(jié)。在白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附過程中，白細胞表面的粘附分子CD11b／CD18及其配體內(nèi)皮細胞粘附分子ICAM－1的相互作用起著關(guān)鍵的作用［15］。本研究中，我們采用流式細胞技術(shù)定量的檢測了NAFLD大鼠外周血中單核細胞以及粒細胞表面粘附分子表達，結(jié)果顯示模型組中單核細胞以及粒細胞表面粘附分子CD11b和CD18的表達均有顯著地升高，而采用DGLL對高脂誘導大鼠進行干預(yù)治療，結(jié)果顯示DGLL可劑量依賴性的顯著抑制NAFLD大鼠外周血白細胞粘附分子的表達。同時，本研究還采用 Western blot的方法證實了NAFLD大鼠肝臟組織中的內(nèi)皮細胞粘附分子ICAM－1的水平顯著升高，DGLL干預(yù)組同樣可以劑量依賴性的抑制內(nèi)皮細胞表面粘附分子的水平，提示DGLL是通過抑制NAFLD大鼠外周血白細胞以及肝臟血管表面粘附分子的表達而抑制了白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，從而進一步抑制了白細胞的活化以及向組織的浸潤過程。我們前期實驗已經(jīng)證實DGLL可以抑制高脂導致的肝臟SOD活性的降低并減少肝臟MDA含量、抑制NAFLD大鼠肝線粒體損傷和肝微粒體CYP2E1的過度表達，從而抑制ROS的過量產(chǎn)生以及DGLL可以抑制NAFLD大鼠 TNF－α的釋放以及 NF－κB信號系統(tǒng)的活化［5］，因此，DGLL抑制粘附分子表達的作用可能與其抑制NAFLD大鼠過氧化物的產(chǎn)生以及炎癥信號通路的作用相關(guān)。

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