陳江帆 姜海嬌 祝 迪 王秀茹 李建華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室，沈陽110001；1沈陽市紅十字會(huì)醫(yī)院病理科，沈陽110013）

腹水可由多種疾病引起，鑒別其性質(zhì)對(duì)臨床治療和預(yù)后的評(píng)估有重要意義。惡性腹水是一種由腹腔原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤引起的并發(fā)癥，也是惡性腫瘤晚期常見的問題。腹水細(xì)胞病理學(xué)檢查是臨床病理學(xué)檢查的主要手段之一，也是幫助臨床查找病因、了解病情進(jìn)展的重要方法。膜式超薄液基細(xì)胞學(xué)檢測（hologic thinprep cytologytest，HOLOGIC TCT）技術(shù)是近年應(yīng)用于臨床細(xì)胞病理學(xué)診斷的一項(xiàng)新技術(shù)，免疫細(xì)胞化學(xué)在脫落細(xì)胞學(xué)檢查中具有重要意義，陳等［1］研究表明液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)檢查在惡性腫瘤細(xì)胞診斷中具有重要意義。本研究是采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)良惡性腹水標(biāo)本MOC－31和CD44v6的含量進(jìn)行檢測，并運(yùn)用液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測MOC－31和CD44v6在良惡性腹水細(xì)胞中的表達(dá)情況，以探討 MOC－31和CD44v6在良惡性腹水鑒別診斷中的臨床價(jià)值。

材料和方法

1.研究對(duì)象

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011年6月至2012年1月門診及病房患者腹水標(biāo)本1680例，應(yīng)用液基細(xì)胞學(xué)薄層涂片技術(shù)初檢，從診斷結(jié)果為查到瘤細(xì)胞標(biāo)本中選取390例，另選取良性腹水標(biāo)本100例，其中男性患者269例，女性患者221例，年齡小于等于50歲者200例，大于50歲者290例，全部病例經(jīng)臨床、CT、磁共振及組織病理學(xué)確診。

2.試劑

MOC－31、CD44v6鼠抗人單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，人 MOC－31、CD44v6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法

3.1 液基細(xì)胞薄層檢測技術(shù)（HOLOGIC TCT）：取50ml腹水2管2000r／min離心5min后，棄掉上清液，加入50ml新柏氏細(xì)胞清洗液繼續(xù)2000 r／min離心5min后，吸取適量沉淀物加入新柏氏細(xì)胞保存瓶，靜置10min左右，用新柏氏液基細(xì)胞儀制成薄層細(xì)胞涂片，95%的酒精固定10min，常規(guī)HE染色。

3.2 MOC－31、CD44v6含量測定：采用 ELISA法測定，MOC－31、CD44v6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，采用美國寶特公司Elx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（波長450nm）比色定量。對(duì) MOC－31、CD44v6含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高值以外的標(biāo)本稀釋10倍后重新測定。所有標(biāo)本均作雙管檢查。

3.3 細(xì)胞包埋切片技術(shù)：取50ml腹水2管2000r／min離心5min后，棄掉上清液，加入95%乙醇固定8h。倒掉上清液后加入二甲苯透明0.5－1h，向透明后的細(xì)胞團(tuán)塊中加入液體石蠟浸透，一般需經(jīng)三次，每次0.5－1h，將浸透石蠟的細(xì)胞團(tuán)塊放入新包埋器中并倒入熔化的新蠟，待石蠟?zāi)毯?，進(jìn)行4μm厚連續(xù)切片。

3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：常規(guī)石蠟包埋切片后，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶法（streptavidin－peroxidase，S－P）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化，0.01mol／L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)3min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液37℃孵育30min；非免疫性羊血清37℃孵育40min；一抗4℃孵育過夜，MOC－31、CD44v6稀釋比例為1∶100；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃孵育30min；鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37℃孵育30min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。各步之間用p H值為7.4左右的PBS沖洗三次，每次5min。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，著色強(qiáng)度分為：無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞數(shù)分為：＜10%為0分，10%－50%為1分，＞50%為2分，兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果＞2記為陽性（＋），＜2為陰性（－）。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)（不滿足條件時(shí)用Fisher確切概率法），兩者相關(guān)性用非參數(shù)spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HOLOGIC TCT結(jié)果

鏡下顯示細(xì)胞散在分布，核異型性明顯，核質(zhì)細(xì)膩，N／C比例失調(diào)，核膜清晰，核大小不等，HOLOGIC TCT初步診斷為可疑瘤細(xì)胞；而在良性腹水中則以炎性細(xì)胞為主（如圖AB所示）。

2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

我們通過液基薄層細(xì)胞涂片（HOLOGIC TCT）篩查出查到瘤細(xì)胞的惡性腹水標(biāo)本，對(duì)惡性腹水標(biāo)本和良性腹水標(biāo)本做石蠟細(xì)胞包埋切片，并進(jìn)一步做免疫組化（如圖1所示）。

圖1 圖A惡性腹水中脫落細(xì)胞液基薄層涂片（HOLOGIC TCT）×400；圖B良性腹水中脫落細(xì)胞液基薄層涂片（HOLOGIC TCT）×400；圖C MOC－31在細(xì)胞膜上陽性表達(dá)（S－P）×400；圖D CD44v6在細(xì)胞膜上陽性表達(dá)（S－P）×400；Fig.1 A Exfoliated cells of malignant ascites（HOLOGIC TCT）×400；B Exfoliated cells of benign ascites（HOLOGIC TCT）×400；C MOC－31 positive expression in the cell membrane（S－P）×400；D CD44v6 positive expression in the cell membrane（S－P）×400；

3.MOC－31在良、惡性腹水標(biāo)本內(nèi)的濃度分別為21±4 ng／ml、98.1±19.3 ng／ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD44v6在良、惡性腹水標(biāo)本內(nèi)的濃度分別為291±32 ng／ml、891±116 ng／ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（如表1）。MOC－31在良、惡性腹水標(biāo)本內(nèi)的表達(dá)率分別為3.00%和75.90%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD44v6在良、惡性腹水標(biāo)本內(nèi)的表達(dá)率分別為0%和71.28%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（如表2）。

表1 良、惡性腹水中MOC31和CD44v6的檢測結(jié)果（±s）Table 1 The test results of MOC－31 and CD44v6 in benign and malignant ascites

表1 良、惡性腹水中MOC31和CD44v6的檢測結(jié)果（±s）Table 1 The test results of MOC－31 and CD44v6 in benign and malignant ascites

Groups Benign ascites Total N ascites Malignant ascites Total N ascites P value MOC－31（ng／ml） 100 21±4 390 98.1±19.3 P＜0.05 CD44v6（ng／ml） 100 291±32 390 891±116 P＜0.05

表2 100例良性腹水與390例惡性腹水中免疫細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)Table 2 The expression of imunocytochemistry in 100 cases benign ascites and 390 cases malignant ascites

4.MOC－31和CD44v6在390例惡性腹水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中總的陽性率分別為64.10%（250／390）和68.21%（266／390）二者陽性表達(dá)率之間成正相關(guān)（R＝0.155，P＝0.002）（如表3）。

表3 390例惡性腹水中MOC－31與CD44v6表達(dá)之間的關(guān)系Table 3 The relationship between MOC－31 and CD44v6 expressions in 390 cases of malignant ascites

5.390例惡性腹水標(biāo)本經(jīng)過臨床及組織病理學(xué)確診為肝癌62例，胃癌117例，結(jié)腸癌105例，卵巢癌55例，胰腺癌27例，膽管癌24例。MOC－31在結(jié)腸癌所致惡性腹水中陽性表達(dá)率相對(duì)較高，CD44v6在胃癌所致惡性腹水中陽性表達(dá)率相對(duì)較高（如表4）。

表4 MOC－31和CD44v6在惡性腹水中的檢測結(jié)果Table 4 Results of MOC－31 and CD44v6 detection in malignant ascites

討 論

腹水是臨床上常見的癥狀，可由腹盆腔惡性腫瘤、肝硬化、結(jié)核性腹膜炎等多種疾病引起。不同病因引起的腹水其治療和預(yù)后截然不同，因此，腹水病因的鑒別尤其是良、惡性腹水的鑒別極為重要。細(xì)胞學(xué)檢查仍為惡性腹水確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感度僅為50%左右［2］，即使有些患者腹水細(xì)胞學(xué)檢查陰性也不能排除腫瘤診斷。腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞合成、分泌或脫落到體液或組織中的生物活性物質(zhì)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展早期影像學(xué)檢查尚未有陽性表現(xiàn)時(shí)，體液中腫瘤標(biāo)志物已有不同程度升高，通過測定其含量和表達(dá)情況對(duì)腫瘤有輔助診斷價(jià)值［3］。因此，檢測腫瘤標(biāo)志物是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的一個(gè)重要手段。在眾多的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物中，MOC－31和CD44v6被認(rèn)為是特異性和敏感性均較高的指標(biāo)［4，5］，對(duì)診斷與鑒別診斷惡性腹水有較高的應(yīng)用價(jià)值。

MOC－31又稱做人類全癌上皮相關(guān)糖蛋白－2（human pancarcinoma associated epithelial glycoprotein－2，EGP－2）［6］，是上皮分化的可靠標(biāo)記物。理論上講，只有上皮來源的細(xì)胞才能表達(dá)MOC－31，非上皮來源的細(xì)胞不表達(dá)，因此檢測 MOC－31表達(dá)與否有助于確定腹腔積液內(nèi)細(xì)胞的來源，良性腹水內(nèi)只存在炎癥細(xì)胞和間皮細(xì)胞，沒有上皮來源細(xì)胞，如果出現(xiàn)MOC－31表達(dá)陽性的細(xì)胞多意味著上皮性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移所致。Delahaye等［7］用漿膜腔積液細(xì)胞涂片作MOC－31免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯示有76%的惡性漿膜腔積液呈陽性，而在增生間皮細(xì)胞中均呈陰性。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示有64.10%（250／390）的惡性腹水腫瘤細(xì)胞表達(dá) MOC－31，僅有5例良性腹水增生間皮細(xì)胞表達(dá)且表現(xiàn)為弱陽性；ELISA結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了MOC－31在良惡性腹水中的濃度具有顯著性差異。

CD44是廣泛存在于細(xì)胞表面的異質(zhì)型跨膜糖蛋白粘附分子，CD44v6是CD44的一種拼接異構(gòu)體，主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)之間特異性的粘連過程。CD44v6改變了腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，使腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，人類多種惡性腫瘤組織［8－10］，如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、鼻咽癌等普遍存在CD44v6的過量表達(dá)，而且CD44v6的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。目前，一般認(rèn)為CD44v6表達(dá)失控與基因突變有關(guān)。CD44v6可通過蛋白水解酶的作用從細(xì)胞膜上脫落下來到血或體液中，從而為利用體液及外周血檢測CD44v6奠定了基礎(chǔ)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有68.21%（266／390）的惡性腹水腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD44v6，而在良性腹水中低表達(dá)。在良、惡性腹水標(biāo)本內(nèi)的濃度分別為291±32 ng／ml、891±116 ng／ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

本研究中還觀察到表達(dá)MOC－31陽性的惡性腹水腫瘤細(xì)胞常常伴隨CD44v6的陽性表達(dá)，且兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)（R＝0.155，見表3），提示MOC－31和CD44v6在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到重要作用，可能存在共同的作用機(jī)制。390例惡性腹水最終經(jīng)過臨床以及組織病理學(xué)確診，MOC－31在結(jié)腸癌引起的惡性腹水中陽性表達(dá)率較高89.52%，CD44v6在胃癌引起的惡性腹水中陽性表達(dá)率較高90.60%（見表4），與國外文獻(xiàn)報(bào)道趨于一致［11，12］。本研究認(rèn)為，ELISA和免疫細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合檢測MOC－31和CD44v6在腹水中的含量和表達(dá)情況有助于良、惡性腹水的鑒別診斷，并有可能作為結(jié)腸癌和胃癌診斷的一個(gè)較為可靠參考指標(biāo)，而且為惡性頑固型腹水的基因治療提供有效靶點(diǎn)，值得在臨床良、惡性腹水鑒別診斷中推廣應(yīng)用。

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